Spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door optogenetische allosterische regulatie

Ons algemene onderzoek richt zich op het ontwikkelen van optogenetische methoden die een nauwkeurige spatiotemporele controle van eiwitactiviteit door licht bereiken. We ontwikkelen lichtreguleerbare domeinen, lightR genaamd, voor allosterische regulatie, waardoor we kunnen bestuderen hoe spatiotemporeel gecontroleerde eiwitactiviteit de cellulaire signalering en functies beïnvloedt, wat helpt bij preklinische ziektemodellering en therapieontwikkeling. Optogenetica staat voor verschillende uitdagingen, waaronder het bereiken van nauwkeurige en omkeerbare controle van de doeleiwitactiviteit en het nauwkeurig nabootsen van endogene signaalkinetiek.

De belangrijkste kwesties zijn het voorkomen van ongewenste activering, het mogelijk maken van gerichte subcellulaire activering en het beheersen van fototoxiciteit om de levensvatbaarheid van cellen te behouden. Bovendien is het ontwikkelen van universeel compatibele en robuuste gereedschappen van cruciaal belang voor het verbeteren van de veelzijdigheid en reproduceerbaarheid in toepassingen. Ons protocol voor het ontwerpen van lightR-tools combineert op unieke wijze meerdere geavanceerde functies in één systeem, waaronder allosterische regulatie, hoge gevoeligheid, ruimtelijke resolutie, strakke temporele controle en nauwkeurige signaleringsspecificiteit.

Deze integratie zorgt voor afstembaarheid tussen verschillende doeleiwitten, waardoor de hiaten in andere methoden worden aangepakt die mogelijk een of meer van deze kritieke mogelijkheden missen. We zijn geïnteresseerd in het definiëren van belangrijke signalerings- en structurele processen die celmigratie reguleren. We willen onze optogenetische technologie gebruiken om regulaties van endotheelcelmigratie en -interacties te ontleden.

Begrijp hoe remodellering van de extracellulaire matrix wordt gemedieerd door endotheelcellen en bepaal hoe ontregeling van deze processen bijdraagt aan de ontwikkeling van de ziekte. Voor biochemische analyse van lichtR-kinasen plaat één keer 10 tot de macht van zes lin XE-cellen voor 3,5 centimeter celkweekschotel voor elke experimentele groep, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 16 tot 18 uur. Transfecteer de volgende dag de cellen met het geselecteerde DNA-construct met behulp van een geschikt transfectiereagens.

Dek de schaal af met aluminiumfolie en doe hem terug in de couveuse. Plaats na 16 tot 18 uur transfectie een 465 nanometer LED-paneellampsysteem in de weefselkweekincubator. Plaats een geperforeerd plexiglas paneel 10 centimeter boven de lamp om een verlichting van drie milliwatt per vierkante centimeter te bereiken.

Gebruik continue verlichting in cellen die LightR-Src en D388 R-LightR-Src tot expressie brengen. Schakel het LED-paneel handmatig in en uit om de verlichting te regelen. Aan het einde van de experimentele tijdstippen oogst u de cellen onder veilig rood licht, zuigt u de media op en wast u de cellen met koud PBS.

Globale verlichting van lin XE-cellen met gemanipuleerde LightR-Src gedurende 60 minuten toont fosforylering van Src-substraten, endogene paxilline en p130Cas-cellen die de katalytische inactieve D388 RLightR-Src-mutant tot expressie brengen, vertonen geen fosforylering van Src-substraten bij globale verlichting. Plaat om te beginnen twee keer 10 tot de macht vijf helacellen per weefselkweekschaal van 35 millimeter in celkweekmedia. Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Zodra de cellen zich hebben gehecht en een confluentie van 60 tot 70% hebben bereikt, cotransfecteert u de hella-cellen met de gegeven mix. Dek de schaal af met aluminiumfolie om te voorkomen dat de cellen per ongeluk worden verlicht. Incubeer de cellen vervolgens 16 tot 18 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Plaats vervolgens afgedekte glazen met een diameter van 25 millimeter en een dikte van 0.17 millimeter in een plaatkamer met zes putjes. Smeer drie ronde glazen afdekslips in met vijf milligram per liter fibronectine in PBS en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Spoel de afdekglaasjes vervolgens 16 tot 18 uur na transfectie af met PBS.

Verzamel de getransfecteerde helacellen in veilig, rood licht en speel vervolgens ongeveer één keer 10 tot de macht vijf getransfecteerde helacellen af op elk afdekglaasje onder veilig, rood licht. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer gedurende twee uur in celkweekmedia bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwarm vervolgens de voorbereide beeldmedia en minerale olie tot 37 graden Celsius.

Was vervolgens de afdekglaasjes met de cellen twee keer met PBS. Na het kleuren en wassen van de cellen, plaatst u het afdekglaasje voorzichtig in een kamer voor live celbeeldvorming. Voeg een milliliter L15-beeldvormingsmedia toe aan de kamer.

Voeg een milliliter voorverwarmde minerale olie toe aan de media om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen. Houd de kamer beschermd tegen licht bij 37 graden Celsius totdat u klaar bent om te fotograferen. Plaats de kamer op een microscooptafel die is voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Selecteer een enkele cel die zowel snelle LightR-Src-kers als Src een IRFP uitdrukt. Selecteer specifieke interessegebieden binnen de cel om te verlichten. Kies voor dit onderzoek een klein gebied aan de rand van de geselecteerde cel.

Beeld de geselecteerde cel elke minuut gedurende 20 minuten in de basale toestand vóór de verlichting. Ga door met beeldvorming gedurende 50 minuten terwijl u plaatselijk verlicht, gevolgd door 20 minuten na activering gedurende in totaal 90 minuten. Sla de films na het maken op in tif stack-bestandsformaat voor analyse.

Wereldwijde verlichting van helacellen leidde tot de lokalisatie van snelle LightR-Src naar focale verklevingen, die werden omgekeerd zodra het blauwe licht werd uitgeschakeld. Deze verlichting veroorzaakte ook een aanzienlijke toename van de celverspreiding, die stopte zodra het blauwe licht werd uitgeschakeld. De katalytische inactieve mutant D388 R-LightR-Src vertoonde geen celspreiding.

Gelokaliseerde verlichting van helacellen die snel LightR-Src tot expressie brengen, resulteerde in de accumulatie van het construct in focale verklevingen, wat leidde tot gelokaliseerde membraanuitsteeksels met 50 minuten verlichting. Er werd geen verdere oppervlaktewinst waargenomen in 20 minuten donker na verlichting. Fast LightR-Src verdween geleidelijk uit de focale verklevingen in de donkere fase.

Het celzwaartepunt verschoof naar het verlichte gebied. Na snelle activering van LightR-Src, wat wijst op gerichte celbeweging.