Single-molecule FRET-beeldvorming voor het observeren van de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine
24 januari 2025
De functies van dynamine-superfamilie-eiwitten zijn afhankelijk van conformationele veranderingen in combinatie met GTP-hydrolyse. Een systeem wordt beschreven met behulp van de single-molecule FRET (smFRET) -techniek om de conformationele dynamiek van dynamin-achtig GTPase-atlastine in verschillende nucleotide-ladende toestanden te volgen.
We zetten ons in om het fusiemechanisme van intracellulaire membranen te bestuderen. In dit protocol streven we ernaar om de conformationele dynamiek van het endoplasmatisch reticulummembraanfusie-eiwit atlastine tijdens de GTP-hydrolysecyclus door smFRET te realiseren. Atlastine kan bestaan als monomeer of dimeer in de GTP-hydrolysecyclus.
In experimenten met één molecuul is het een uitdaging om geschikte eiwitlabeling en immobilisatiestrategieën te vinden, en het volgende presenteert de conformationele dynamiek van atlastine gedurende de GTP-hydrolysecyclus. Vergeleken met bulk FRET kan smFRET eiwitconformaties nauwkeurig monitoren onder verschillende nucleotide-ladende toestanden, waardoor direct inzicht wordt verkregen in het gedrag van modulatormoleculen. We gebruikten de smFRET om de GTP-hydrolysecyclus van atlastine volledig op te lossen tijdens verschillende positiestrategieën.
Wij zijn van mening dat onze bevindingen meer conformationele dynamiek zullen bevorderen bij het bestuderen van GTP-hydrolyse-eiwitten en nieuwe interpretaties van zeldzame biologische processen zullen opleveren. Om het oppervlak van het dekglaasje schoon te maken, gebruikt u een pincet om acht dekglaasjes op te pakken en plaatst u ze in een vlekkenpotje. Voeg 50 milliliter aceton toe om de dekglaasjes te bedekken en plaats het kleurpotje 30 minuten in een ultrasone reiniger.
Spoel de dekglaasjes drie keer af met dubbel gedestilleerd water en was ze met methanol in een ultrasone reiniger. Voeg vervolgens de piranha-oplossing toe aan de kleurpot en verwarm deze twee uur in een waterbadketel op 95 graden Celsius. Nadat je de pot hebt afgekoeld tot kamertemperatuur, spoel je de dekglaasjes zes keer af met dubbel gedestilleerd water.
Voeg natriummethoxideoplossing toe aan de kleurpot en plaats deze 15 minuten in de ultrasone reiniger. Nadat u de dekglaasjes met water hebt afgespoeld, voegt u dubbel gedestilleerd water toe aan het kleurpotje en plaatst u het 15 minuten in de ultrasone reiniger. Klem de dekglaasjes in het kleurpotje en droog ze af met stikstof.
Doe de gedroogde dekglaasjes in een andere kleurpot en bak de pot 30 minuten in een droogoven op 120 graden Celsius. Koel de pot vervolgens af tot kamertemperatuur in een exsiccator Voeg 47,5 milliliter methanol, 2,5 milliliter azijnzuur en 0,5 milliliter triethoxysilaan toe aan een bekerglas en meng gelijkmatig.
Breng het mengsel over in de kleurpot en incubeer gedurende 10 minuten. Spoel de dekglaasjes drie keer af met dubbel gedestilleerd water in de kleurpot en soniceer gedurende vijf minuten. Nadat u de dekglaasjes met water hebt afgespoeld en met stikstof hebt afgedroogd, zoals aangetoond, plaatst u de dekglaasjes in een petrischaaltje met een diameter van 10 centimeter.
Los SVA-mPEG en SVA-mPEG-Biotine op in de zoutrijke oplossing in een verhouding van 1:100. Laat het voorbereide mengsel op een dekglaasje vallen en bedek het met een ander dekglaasje. Incubeer de dekglaasjes gedurende twee uur of een nacht met de juiste vochtigheid.
Haal na wijziging de dekglaasjes uit elkaar, spoel ze af met gedeïoniseerd water en föhn ze droog met stikstof. Plaats het aangepaste dekglaasje voorzichtig in een tube van 50 milliliter. Na het zuiveren van het GTPase-domein van dynamin-achtig eiwit atlastine of ATL dat tot expressie wordt gebracht in Rosetta E.coli-cellen, verandert u de eiwitbuffer in de eiwitbiotinyleringsbuffer met behulp van een centrifugaalfilter van 10 kilodalton.
Meng voor eiwitbiotinylering 100 microliter ATP, 100 millimolair magnesiumacetaat en 500 micromolair D-biotine, 10 microliter 100 micromolair BirA biotineligase en 50 micromolair eiwit tot een eindvolume van één milliliter. Incubeer het mengsel een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de vrije D-biotine met behulp van een centrifugaalfilter van 10 kilodalton met molecuulgewicht.
Incubeer 20 microliter gebiotinyleerd eiwit met 20 microliter 15-micromolaire streptavidine gedurende 20 minuten op ijs. Detecteer de efficiëntie van eiwitbiotinylering met behulp van SDS-PAGE. Los LD555- en LD655-fluoroforen op in dimethylsulfoxide tot een uiteindelijke concentratie van vijf millimolair.
Om de etiketteringsbuffer voor te bereiden, mengt u 25 millimolaire HEPES, 150 millimolair kaliumchloride en vijf millimolair magnesiumchloride. Verander de eiwitbuffer in de etiketteerbuffer met behulp van een centrifugaalfilter van 10 kilodalton. Meng voor intramoleculaire smFRET-assays ATL1cyto-TK met LD555 en LD655 in een verhouding van 1:1.2:1.2 tot een eindvolume van 100 microliter.
Incubeer het mengsel gedurende vijf uur bij vier graden Celsius. Voor intermoleculaire smFRET-assays wordt ATL1cyto-K met LD555 en gebiotinyleerd ATL1cyto-K met LD655 gedurende vijf uur bij vier graden Celsius geïncubeerd. Om de eiwitimmobilisatiekamer voor te bereiden, plakt u het gewijzigde dekglaasje en het microscoopglaasje voorzichtig op met op maat gemaakte dubbelzijdige tape.
Installeer slangen en tips om een microfluïdische kamer met zes kanalen te vormen. Voeg voor het in kaart brengen van correcties 10 microliter 10% polystyreendeeltjes toe aan een microscoopglaasje en bedek het met een dekglaasje. Selecteer vervolgens onder een fluorescentiemicroscoop met totale interne reflectie een gezichtsveld met polystyreendeeltjes en maak een video in een helderveldmodus.
Gebruik een aangepast script om de middenlocatie van hetzelfde polystyreendeeltje uit te lijnen in zowel het donor- als het acceptorkanaal. Sla het kaartbestand op als een TXT-bestand. Meng voor intermoleculaire smFRET-experimenten LD555 met het label ATL1cyto-K met LD655 met het label ATL1cyto-K-biotine in een één-op-één-verhouding met een uiteindelijke concentratie van één millimolair GTP-gamma-S.
Incubeer het mengsel een uur op ijs om de eiwitten te dimeriseren. Meng LD555 gelabeld ATL1cyto-T met LD655 gelabeld ATL1cyto-K-biotine in een één-op-één verhouding met één millimolaar GTP-gamma-S voor ATL1cyto-T en ATL1cyto-K intermoleculaire smFRET-experimenten. Incubeer het mengsel gedurende een uur op ijs om gedimeriseerde eiwitten te verkrijgen.
Incubeer vervolgens voor intramoleculaire smFRET-assays LD555 en LD655 gelabeld ATL1cyto-TK met één millimolair BBP op ijs gedurende één uur. Incubeer voor intermoleculaire experimenten 10 microgram per milliliter streptavidine gedurende 10 minuten om eiwitten te immobiliseren. Voeg voor intramoleculaire tests 10 microgram per milliliter gebiotinyleerd anti-His-antilichaam toe en incubeer gedurende 10 minuten om eiwitten te immobiliseren.
Voeg na incubatie het verdunde ATL1-dimeer toe aan het eiwit in het kanaal en laat het 10 minuten immobiliseren. Spoel het kanaal twee keer door met een incubatiebuffer. Voeg benzoëzuur en PCD toe aan het kanaal in een eindconcentratie van 2,5 millimolair.
Selecteer de laser van 532 nanometer als excitatielichtbron. Stel de EMCCD-camera in om gegevens op te nemen met een frame-interval van 30 milliseconden. Sla de opgenomen films op in 16-bits TIFF-indeling.
Extraheer na gegevensverzameling FRET-tracks uit de opgenomen films. Selecteer en bewaar FRET-tracks in TXT-indeling. Extraheer de gegevens uit de TXT-bestanden en bereken de FRET-waarden met behulp van zelfgemaakte scripts in MATLAB.
Pas de smFRET-gegevens van GaussAmp in Origin aan om het distributiehistogram te verkrijgen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de conformationele dynamica van het endoplasmatisch reticulum membraanfusie-eiwit atlastin tijdens zijn GTP-hydrolysecyclus met behulp van single-molecule FRET (smFRET). Het onderzoek benadrukt de uitdagingen van eiwitlabeling en immobilisatiestrategieën in single-molecule experimenten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Biofysica
Achtergrond
- Dynamine-superfamilie-eiwitten zijn cruciaal voor membraanfusie.
- Atlastin kan bestaan in monomeer of dimeer vormen tijdens GTP-hydrolyse.
- Single-molecule FRET geeft inzicht in eiwitconformaties.
- Het begrijpen van atlastin-dynamica is essentieel voor het ophelderen van membraanfusiemechanismen.
Doel van studie
- Om de conformationele veranderingen van atlastin tijdens GTP-hydrolyse te onderzoeken.
- Om smFRET te gebruiken voor het monitoren van eiwitdynamica onder verschillende nucleotide-loading-toestanden.
- Om uitdagingen in eiwitlabeling en immobilisatie in single-molecule studies aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Single-molecule FRET (smFRET) techniek.
- Experimentele strategieën voor eiwitlabeling.
- Immobilisatietechnieken voor single-molecule experimenten.
- Analyse van GTP-hydrolysecyclusdynamica.
Belangrijkste resultaten
- smFRET monitort effectief atlastin-conformaties.
- Verschillende nucleotide-loading-toestanden beïnvloeden atlastin-dynamica.
- Uitdagingen in labeling en immobilisatie werden aangepakt.
- Inzichten in de GTP-hydrolysecyclus van atlastin werden verkregen.
Conclusies
- smFRET is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitdynamica.
- Het begrijpen van atlastin's conformationele veranderingen helpt bij het begrijpen van membraanfusiemechanismen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om andere dynamin-achtige eiwitten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-molecule FRET (smFRET) imaging of atlastin provides direct, quantitative insight into the conformational dynamics underlying GTPase-driven membrane fusion, a process relevant to neurodegenerative disease mechanisms. This approach enables high-resolution interrogation of mechanochemical protein function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The method's precision in monitoring nucleotide-dependent conformational states positions it as a reusable capability for biopharma discovery pipelines focused on membrane fusion and GTPase biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of conformational transitions in disease-relevant GTPases.
- Supports mechanistic de-risking by linking nucleotide state to structural dynamics.
- Facilitates functional target validation through real-time single-molecule analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage of membrane fusion targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule assays for quantitative conformational readouts.
- Enables reproducible measurement of protein dynamics under defined nucleotide states.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators or inhibitors.
- Provides a platform for scalable, high-content mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns conformational biomarkers with disease-relevant mechanistic endpoints.
- Ensures continuity from molecular discovery to preclinical validation of GTPase function.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative mechanistic evidence.
- Supports translational research into rare neurodegenerative disorders linked to atlastin dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
smFRET imaging of atlastin integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research, enabling iterative hypothesis testing and functional validation.
- Discovery Biology: Provides quantitative evidence for conformational changes during GTP hydrolysis, clarifying mechanistic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET outputs for comparative analysis of nucleotide states and modulators.
- Analytics: Generates high-content single-molecule data for statistical comparison of protein conformations.
- Translational Research: Links molecular dynamics to disease-relevant phenotypes in neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform for studying other mechanochemical proteins beyond atlastin.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane fusion and GTPase-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence and protein biochemistry.
- Demands specialized instrumentation such as TIRF microscopy and EMCCD cameras.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of labeling and immobilization protocols.
- Adaptation to other mechanochemical proteins may require optimization of labeling strategies.
- Throughput and data analysis depend on robust computational infrastructure and custom scripts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Preparation and Modification of Coverslips for Protein Immobilization in Chambers
4:12
Protein Biotinylation and Fluorophore Labeling for Single-Molecule Frster Resonance Energy Transfer (smFRET) Assays
6:41
Single-Molecule FRET Imaging and Data Analysis for GTP Hydrolysis Cycle of Atlastin
