Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

De rol van bepaalde genen op het ontstaan en de ontwikkeling van trombose, in dit geval onderzoeken we de endotheliale PAR1-expressie op ischemie-reperfusieschade. We proberen het effect van het endotheel op de respons vast te stellen, zowel na ischemie als tijdens reperfusie. Een heel belangrijk aspect dat tot nu toe onderbelicht is, is het vaststellen van de rol van darmcommensalen bij mesenteriale ischemie-reperfusieschade.

Om deze vraag te bestuderen, combineerde onze groep intravitale microscopie met een mesenteriale ischemie-reperfusieschademodel, en we combineerden dat met kiemvrije muismodellen. De toepassing van trombosemodellen op transgene muizen in combinatie met intravitale microscopie, dergelijke technologieën maken de in vivo observatie van cellulair gedrag tijdens het begin van de ziekte mogelijk. Het uitvoeren van experimentele modellen op levende organismen is altijd een uitdaging, omdat het experiment wordt beïnvloed door vele factoren, waaronder geslacht, leeftijd, anesthesiebehandeling, veranderingen in dierenwelzijnsvoorschriften, enzovoort.

Ook het onderzoek naar trombose is in de vorige eeuw begonnen. Veel bijdragende factoren zijn nog niet opgelost. Mijn groep bestudeert de rol van de darmmicrobiota op trombose, atherosclerose, bloedplaatjesfunctie en vascularisatie.

Plaats om te beginnen de verdoofde, geschoren muis in een dorsale lighouding op een verwarmingskussen. Sluit de muis via een neuskegel aan op het zuurstofsysteem. Bevestig de ledematen van de muis aan het verwarmde kussen met chirurgische tape.

Voor de implantatie van de katheter in de halsader maakt u een transversale incisie over de luchtpijp. Verwijder de huid die de nek bedekt en isoleer de rechter halsader. Sluit vervolgens met behulp van een zijden draad van vijf centimeter het distale uiteinde van de ader en bevestig het met een chirurgische tang.

Plaats drie zijden draden ongeveer twee centimeter onder de ader, één bij het distale uiteinde en twee bij het proximale uiteinde van de halsader. Leg een chirurgische knoop, maar sluit het vat niet. Vul een polyethyleenkatheter met 0,9% natriumchloride.

Verwijder luchtbellen en sluit deze aan op een spuit van één milliliter. Gebruik een schaar om een gat tussen de tweede en derde knoop te knippen en implanteer de katheter in de halsader. Zuig de spuit op om er zeker van te zijn dat er bloed in de katheter aanwezig is.

Bind de zijden draad vast om de katheter in de ader vast te zetten. Gebruik vervolgens een medische tape om de spuit vast te zetten. Vul spuiten van één milliliter met acridine-sinaasappel met een eindconcentratie van 0,5 milligram per milliliter en nucleïnezuurkleurstof met een concentratie van vijf micromolaren.

Injecteer 50 microliter SYTOX Orange voor neutrofiele extracellulaire vallen of NET's. Desinfecteer de buikhuid van de muis met afwisselende rondes scrubs op basis van jodium en alcohol. Voer vervolgens met behulp van een scalpel een laparotomie van drie tot vijf centimeter uit langs de lineaire alba.

Plaats de darm voorzichtig uit de buikholte met behulp van twee met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes en identificeer een locatie met minimale vetbedekking. Plaats kleine takjes van de darm op een zwart deeg om het achtergrondsignaal te verminderen. Injecteer 50 microliter acridine-sinaasappel door de halsaderkatheter om de gekleurde leukocyten zichtbaar te maken.

Verkrijg de video van de darm vóór ischemie-reperfusie. Maak een kompres bevochtigd met natriumchloride en plaats de darm erin. Sluit de superieure mesenteriale slagader af met een kleine vasculaire klem.

Duw de darm voorzichtig terug in de buikholte met behulp van met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes. Gebruik een 7-0 hechting om de buikwand te sluiten en verlies van vocht en temperatuur te voorkomen. Verwijder na een uur de hechtdraad.

Breng na de ischemische periode een paar druppels zoutoplossing aan op het geknipte gebied. Verwijder vervolgens voorzichtig de microvasculaire clips met behulp van een clip-applier. Plaats met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes de darm voorzichtig weer uit de buikholte en plaats de kleine vertakkingen van de ader op een zwart deeg.

Injecteer 50 microliter acridine-sinaasappel en leg de post-ischemische video van de ader vast. Schakel de snelle breedveldfluorescentiemicroscoop in die is uitgerust met een langeafstandscondensor, een monochromator, een 10-voudig wateronderdompelingsobjectief en een camera met gekoppelde lading. Stel de belichtingstijd in op 30 milliseconden en selecteer het 5B-kanaal met geïnstalleerde Alexa Fluor 488- en Rhodamine Red-filters om de leukocyten en NET's te visualiseren.

Kwantificeer de rekrutering van cellen binnen een interessegebied van 0,06 vierkante millimeter. Kwantificeer vervolgens adherente leukocyten door cellen te tellen die stationair bleven of aan de endotheelwand vastzaten gedurende een observatieperiode van 20 seconden. Identificeer NET gelabeld met zowel leukocyten als nucleïnezuur fluorescerende kleurstoffen.

De adhesie van leukocyten aan het ischemische mesenteriale endotheel nam toe in zowel wildtype als F2r delta EC-groepen na ischemie-reperfusieschade, met een opmerkelijk lagere adhesie waargenomen in de F2r delta EC-groep, wat een rol van endotheliale PAR1 impliceert bij de rekrutering van leukocyten. Na ischemie-reperfusieschade werden NET's alleen waargenomen in de wildtype groep die normale niveaus van PAR1 op de endotheelcellen tot expressie bracht, wat wijst op een regulerende rol van PAR1 bij NETosis.