Name: Gebruik van Mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Ontdek hoe Mycobacterium smegmatis dient als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën. Deze methode maakt gestandaardiseerde productie van translationeel actieve ribosomen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Science Foundation (NSF) CAREER Award 1844854, de American Lung Association Innovation Award IA -937538 en het National Institute of Health (NIH) NIAID R21 AI109293 aan S.P. Het huidige adres voor Allexa D. Burger is het Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaii, VS.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

<ol><li>Alloway, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+factors+associated+with+zinc+deficiency+in+crops+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Health%22%5BJournal%5D)">Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans.</a> Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).</li>
<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
<li>Dow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+limitation+triggers+anticipatory+adaptations+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).</li>
<li>Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+does+not+necessarily+induce+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).</li>
<li>Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+specifies+involvement+of+alternative+ribosomal+proteins+in+response+to+zinc+limitation+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis.</a> Front Microbiol. 13, 811774(2022).</li>
<li>Singh, A. K., Reyrat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+Leucine+and+Pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs.</a> Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+a+fluorescent+compound+factor420%2C+from+Methanobacterium+strain+M.o.H%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H.</a> J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Een grote bijdrage aan de kenniskloof over de mechanistische grondslagen van Alt-ribosomen is de moeilijkheid om Zn2+-beperkende omstandigheden in vitro te bereiken. Sporen van Zn2+-besmetting in het laboratorium is gebruikelijk; dus is het uitdagen om reproduceerbare Zn2+-beperkte groeiomstandigheden te bereiken. Zn2+-besmetting kan uit verschillende bronnen komen, hoewel de belangrijkste en meest voorkomende bron van besmetting en variabiliteit afkomstig is van het ultrapuur water dat wordt gebruikt om laboratoriumglaswerk te spoelen en media te maken. Ultrapuur watersystemen moeten goed worden onderhouden en moeten 1 minuut worden gespoeld voordat laboratoriumglaswerk wordt gespoeld of water voor media wordt gebruikt. Flessen die niet goed worden gewassen of gespoeld met ultrapuur water kunnen Zn2+-besmetting veroorzaken, en dit zal duidelijk zijn door de verhoogde celdichtheid in bepaalde flesjes maar niet in andere van dezelfde batch ZLM. Gloednieuwe flessen kunnen worden gebruikt om te beoordelen of de bron van Zn2+-besmetting afkomstig is van hergebruikte flessen of media. Zn2+-besmetting in ZLM moet worden verholpen door verhoogd spoelen van items die worden gebruikt om media te maken en een aangewezen set materialen voor ZLM-voorbereiding. Als geen van deze maatregelen succesvol blijkt om de verwachte bioindicator-fenotypen te bereiken, moet de [Zn2+] in ultrapuur water en ZLM worden gekwantificeerd om de mogelijkheid uit te sluiten dat de waterbron Zn2+-besmet is. Zoals eerder gerapporteerd, is de [Zn2+] van ZLM 115 ± 37 nM23, en concentraties onder de 70 nM en boven de 150 nM leidden meestal tot Zn2+-uitgeputte en Zn2+-besmette fenotypen, respectievelijk. Echter, goede mediavoorbereiding is slechts één factor die het resultaat beïnvloedt, en ontoereikend of overmatig Zn2+ kan optreden als gevolg van de onjuiste voorbereiding van het inoculum en/of het kweken, dwz. slecht aftappen van Zn2+-rijk media tijdens wasstappen. Alle M. smegmatis culturen die hier worden opgenomen, zijn op dezelfde manier bereid - Zn2+-besmette (ZLM-C) en Zn2+-uitgeputte (ZLM-D) groeiresultaten zijn opgenomen om de variabiliteit te benadrukken die kan optreden tussen verschillende batches van media die hetzelfde ultrapuur watersysteem gebruiken, zelfs wanneer experimenten correct worden uitgevoerd.
Om ervoor te zorgen dat het kweken van cellen in ZLM reproduceerbare Zn2+-beperkende bioindicator-fenotypen oplevert, is het belangrijk om de flessen uniek te labelen, ze altijd voor dezelfde omstandigheden te gebruiken (dwz. met ZLM of ZRM), flessen bij te houden over meerdere gebruiken en flessen weg te gooien die aan het einde van hun levenscyclus zijn, of die blijven leveren Zn2+-besmette bioindicator-fenotypen met ZLM. De juiste inoculumvoorbereiding is erg belangrijk om Zn2+-beperkende groei te bereiken, aangezien Zn2+-overdracht van onvoldoende gewassen zaaicelkjes een veelvoorkomende bron van Zn2+-besmetting is die moeilijk te onderscheiden kan zijn van Zn2+-besmet ZLM. M. smegmatis culturen moeten worden onderzocht en geoogst na 72 uur groei in ZLM (en ZRM parallel gekweekt). De morfogenese en bioindicator-fenotypen zijn uitgesproken van 48-72 uur; daarom kan het evalueren of oogsten van culturen voor Zn2+-beperking te vroeg (of te laat) niet het volledige bioindicator-fenotype opleveren. Culturen die zijn uitgeput in Zn2+ zullen cellengtes vertonen die vergelijkbaar zijn met die welke Zn2+-besmet zijn; dus F420 fluoresceren en OD600 moet worden gebruikt om de twee te onderscheiden. Evenzo kunnen Zn2+-besmette culturen niet altijd beter groeien dan Zn2+-beperkte bacteriën, maar F420 fluoresceren en de cellengte van het wild type en de ΔaltRP mutant zou moeten onthullen of de Zn2+-beperkte conditie is bereikt.
Hetzelfde geldt voor M. tuberculosis, aangezien het verlies van F420 bioindicator-fenotype in Zn2+-beperkte culturen uitgesproken is tussen 8-10 dagen groei in ZLM. Hoewel M. tuberculosis geen sterk Zn2+-beperkt bioindicator-fenotype vertoont zoals M. smegmatis, is de hier gepresenteerde groeimethode gebruikt om verlies van F420 bioindicator-fenotype te associëren met Zn2+-beperkte groei door middel van functionele assays en transcriptomics in zowel de virulente als afgezwakte stammen van M. tuberculosis (ref23 en ongepubliceerde gegevens). Daarom is het volgen van F420 fluoresceren een toegankelijke manier om biologische Zn2+-beperkende omstandigheden in M. tuberculosis te controleren en te verifiëren. Het is belangrijk op te merken dat het mechanisme dat leidt tot verminderde F420 fluoresceren tijdens Zn2+-beperkende omstandigheden nog niet is opgehelderd, evenals het onderscheid of de verminderde fluoresceren te wijten is aan verminderde abundantie van het co-enzym pool als geheel of een verschuiving in zijn redoxtoestand, aangezien alleen de geoxideerde vorm fluoresceren uitzendt29.
Zoals hier aangetoond, is de voorbereiding van Zn2+-beperkende media gen

Zinkion (Zn2+) is een essentieel micronutriënt en een standaard bestanddeel van microbiologische media. Veel bacteriën ondervinden echter beperkingen in Zn2+ in hun omgeving omdat Zn2+-beperkende omstandigheden wijdverbreid zijn; bodem1, zee2 en niches binnen de gastheer3 zijn vaak Zn2+-beperkt. Daarom hebben de meeste bacteriën mechanismen ontwikkeld om Zn2+-beperking te overwinnen en cellulaire functies te behouden4. Systemen die betrokken zijn bij het handhaven van Zn2+-homeostase staan onder strikte transcriptionele controle5 en zijn betrokken bij het vergaren van Zn2+ met behulp van Zn2+-importsystemen met hoge affiniteit, het mobiliseren van cellulaire Zn2+-reserves en het vervangen van bepaalde Zn2+-bindende eiwitten door alternatieve Zn2+-onafhankelijke paralogen6. Een voorbeeld van het laatste zijn Zn2+-onafhankelijke ribosomale eiwit (RPs) paralogen, die een veel voorkomend kenmerk zijn van Zn2+-responsieve regulons in bacteriën4. Deze zeer uiteenlopende Zn2+-onafhankelijke RPs onderscheiden zich van hun Zn2+-bindende paralogen door de verstoring van het Zn2+-bindende CXXC-motief7. Meer dan de helft van de gesequencede prokaryotische genomen bevat ten minste één paar gedupliceerde RPs waarin, in veel van hen, één RP Zn2+ bindt, terwijl zijn paraloog dat niet doet8. Terwijl de C+/C- notatie (die de aanwezigheid/afwezigheid van het cysteïnerijke Zn2+-bindende motief aangeeft) vaak wordt gebruikt met betrekking tot deze paraloge RP-paren7, zijn Zn2+-onafhankelijke RPs ook beschreven als alternatieve (Alt) versies van de primaire (Prim), Zn2+-bindende RP-paralogen, aangezien AltRPs in sommige bacteriën dienen als alternatieve RPs voor ribosoombiosynthese onder Zn2+-beperkte omstandigheden en het is een trefwoord met betere zoekbaarheid9,10,11.
Omdat AltRP-expressie strikt wordt gereguleerd door Zn2+, is het logisch om aan te nemen dat AltRP-expressie functionele redundantie biedt aan Zn2+-afhankelijke ribosomale eiwitten in geval van Zn2+-beperking. Inderdaad is deze eigenschap van AltRPs aangetoond voor het modelgrondbacterie Bacillus subtilis, waar groei wordt gered tijdens Zn2+-beperking door het vrijmaken van het oppervlakte-PrimRP L31 en het vervangen door het AltRP L3112,13. Sommige AltRPs zijn echter paraloog aan kern-PrimRPs, bijv. S14, wat betekent dat hun incorporatie vereist is tijdens ribosoombiosynthese12,13. Het herstellen van het ribosoom met AltRPs is een vastberaden, energie-intensief programma. Hoewel deze kern-AltRPs kunnen dienen om Zn2+ uit het ribosoom te bevrijden, is het ook mogelijk dat sommige AltRPs een extra functie hebben geëvolueerd in de Zn2+-beperkte omgeving. Dit wordt ondersteund door de observatie dat AltRPs verschillen van hun paraloge PrimRPs; sequentiehomologie van AltRP-genen is vaak hoger onder homologen in verschillende soorten dan bij de Zn2+-bindende PrimRP-gensequentie binnen dezelfde soort7,10. Omdat genen die coderen voor zeer uiteenlopende AltRPs onder Zn2+-afhankelijke transcriptionele controle staan, worden ze vrijgesteld van de selectiedruk die wordt uitgeoefend op de strikt gereguleerd en hoog geconserveerde ribosomale superoperons14. Ontkoppelde selectiedruk op de genetische informatie die de ribosomale machinerie en AltRPs codeert, stelt deze RPs bloot aan verschillende evolutionaire trajecten dan de homologe PrimRPs en zou kunnen zorgen voor lijnspecifieke evolutie van dezelfde AltRP in verschillende bacteriën10,15. De wijdverbreide aanwezigheid van AltRPs in bacteriën en de ontkoppelde genetische regulatie van deze unieke RPs roepen een interessante vraag op of de incorporatie van AltRPs in bacteriële ribosomen een speciale eigenschap verleent aan AltRP-bevattende ribosomen (Alt-ribosomen).
Mycobacteriën zijn een ideale groep bacteriën om de mechanistische eigenschappen van Alt-ribosomen te onderzoeken. Ten eerste bezitten mycobacteriën een sterk geconserveerd altRP operon dat vier genen bevat die coderen voor AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 en L33-28,9. Mycobacteriële AltRPs zijn aanzienlijk verschillend van hun PrimRP-paralogen; in alle vier de PrimRP/AltRP-paren is een bepaald AltRP-gen over alle mycobacteriumsoorten meer vergelijkbaar dan het is met het PrimRP-gen in dezelfde soort10. Lijnspecifieke evolutie van AltRPs is ook duidelijk binnen mycobacteriën, zoals blijkt uit AltRPs S18-2 en L28-2 in Mycobacterium tuberculosis en M. bovis, die unieke sequenties bevatten aan het C-uiteinde die niet aanwe

<table><tbody><tr><td>1000 mL Vacuum Filtration Systems, Standard Line</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Erlenmeyer Shaker Flasks</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Shaker Flasks</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Lab Binocular Biological Compound Microscope</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Bio-Reaction Tubes, Sterile</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 mL High-Performance Centrifuge Tubes with Flag Caps</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Low-Foaming Powdered Detergent</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron (III) citrate, brown</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g/mol, for 1M solution add 1.325 g to 5 mL ultrapure water; store protected from light at 4 C</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium D-Pantothenate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid anhydrous, crystalline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600 for the Determination of Cell Density and Bradford Assays</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>Discontinued</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Multimode Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD camera</td><td>Optronics</td><td></td><td>For use with Olympus microscope</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Direct 8 Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Discontinued, replaced by Moticam X5 Plus; for use with compound microscope</td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 upright microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Discontinued, replaced by BX53M</td></tr><tr><td>Potassium phosphate, monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Micro Two-Sided Disposable Plastic Cuvettes</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, crystal</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Zinc sulfide heptahydrate, crystalline/ACS</td><td>MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

Veel bacteriën bouwen alternatieve ribosomen in Zn2+-beperkende groeicondities door Zn2+-bindende ribosomale eiwitten te vervangen door Zn2+-onafhankelijke paralogen. Het definiëren van een systeem om deze alternatieve ribosomen te bestuderen, is moeilijk gebleken omdat Zn2+-besmetting in het laboratorium gebruikelijk is. Om dit probleem aan te pakken, worden soms chelerende middelen toegevoegd aan groeimedia, maar deze aanpak bemoeilijkt het biologische antwoord op geleidelijke Zn2+-beperking en gaat gepaard met ribosomenhibernatie. Hier worden gedetailleerde instructies geschetst voor het bereiden van media en het zaaien van culturen voor Zn2+-beperkte groei zonder chelatoren toe te voegen. Volgens deze methode ondergaat het modelbacterie, Mycobacterium smegmatis, morfogenese, die afhankelijk is van alternatieve ribosomen. Omdat morfogenese hanteerbaar is en alleen plaatsvindt onder Zn2+-beperkende condities, kan M. smegmatis worden gebruikt als bio-indicator om biologisch relevante groeicondities te verifiëren. Drie bio-indicator-fenotypen (celdichtheid, cellengte en co-enzym F420-fluorescentie) die Zn2+-beperking in het wildtype aangeven, worden beschreven, en veranderingen in deze bio-indicatoren voor een deletie-mutant die geen alternatieve ribosomen kan bouwen, worden geschetst. Aangezien sporen van Zn2+-besmetting moeilijk te controleren is voor elke batch media, en precieze kwantificering van Zn2+ in elke mediavoorbereiding overdreven belastend is, is het volgen van dit bio-indicator-fenotype een toegankelijke manier om de bereiding van Zn2+-beperkt groeimedia te valideren. Om de juiste condities voor Zn2+-beperkte groei en alternatieve ribosoombaan te helpen identificeren, werden veranderingen in de bio-indicator-fenotypen ook geprofileerd voor Zn2+-verontreinigde of ernstig Zn2+-gedepleteerde bereidingen van Zn2+-beperkt media. Verdere details om Zn2+-beperkte groei en alternatieve ribosoombaan in M. tuberculosis te bereiken, worden gepresenteerd, samen met het bijbehorende bio-indicator-fenotype. Over het algemeen zullen de gedetailleerde instructies en bio-indicator-fenotypen die hier worden beschreven, helpen bij het standaardiseren van de productie van translationeel actieve alternatieve ribosomen in mycobacteriën.

Bioindicatorfenotypes van M. smegmatis 
Wildtype M. smegmatis-culturen gekweekt in ZLM die Zn2+-beperkte groei vertonen, hebben drie belangrijke bioindicatorfenotypes in vergelijking met cellen gekweekt onder Zn2+-verzadigde condities: [1] verlaagde OD600, [2] verlengde cellen en [3] verlaagde piekfluorescentie bij 420 nm. De mutant die AltRP's mist (ΔaltRP) vertoont niet dezelfde Zn2+-afhankelijke morfogenese als het wildtype10, en het unieke fenotype in Zn2+-beperkte media kan als differentiële bioindicator worden gebruikt. Daarom moeten alle drie de bioindicatormetrieken eerst worden geëvalueerd in het wildtype gekweekt in ZRM en ZLM. Indien het verwachte Zn2+-beperkte wildtypefenotype wordt waargenomen, moet vervolgens de ΔaltRP-deletiestam worden geëvalueerd. Groei in ZLM bereikt niet altijd Zn2+-beperkte condities, wat precies de reden is waarom bioindicatoren nodig zijn. Unieke bioindicatorfenotypes van het wildtype en ΔaltRP verifiëren dat biologisch relevante Zn2+-beperkende condities zijn bereikt. Wanneer culturen gekweekt in ZLM geen Zn2+-beperkte groei vertonen als gevolg van Zn2+-contaminatie in de media of cultuurvaten (ZLM-C), zullen deze bioindicatorfenotypes minder uitgesproken zijn, zoals getoond in Figuur 1 en Figuur 2. Omgekeerd, indien de concentratie Zn2+ in ZLM te laag is, wordt de groei belemmerd door Zn2+-uitputting (ZLM-D), wat duidelijk is aan een lage cultuurtroebelheid en gewijzigde bioindicatorfenotypes, eveneens gedetailleerd in Figuur 1 en Figuur 2.
Celdichtheid is een sterke maatstaf voor Zn2+-beperking. Culturen gekweekt in ZRM bereiken na 72 u consistent een hoge troebeling (OD600 boven de 5), mogelijk met klontering, en zijn zichtbaar geler (gegevens niet getoond) dan culturen gekweekt in ZLM (Figuur 1A). Zn2+-beperking remt de groei (gekenmerkt door een lagere OD600) van alle stammen in vergelijking met de Zn2+-verzadigde conditie, waarbij de ΔaltRP-stam een lagere celdichtheid vertoont dan het wildtype (Figuur 1A). Zn2+-beperkte groei in ZLM resulteert consistent in een OD600 tussen 3,5 en 5 bij het wildtype en minder dan 3 bij de ΔaltRP-stam (Figuur 1A). Culturen gekweekt in ZLM met Zn2+-contaminatie (ZLM-C) bereiken een vergelijkbare celdichtheid (OD600 boven de 5) als Zn2+-verzadigde culturen gekweekt in ZRM (Figuur 1A). Als de [Zn2+] in ZLM te laag is, zullen culturen ernstig uitgeput zijn van Zn2+ (ZLM-D) en is de groei belemmerd, wat blijkt uit de lagere celdichtheid in wildtype-culturen (OD600 is minder dan 3; Figuur 1A). De celdichtheid van het wildtype (3,5 &lt; OD600 &lt; 5) dient als eerste bioindicator-fenotype controlepunt om de Zn2+-beperkende condities te verifiëren. Alleen wildtype-culturen die groeien tot de verwachte celdichtheid mogen worden meegenomen, en de analyse van de ΔaltRP -stam moet volgen na de verificatie van het Zn2+-beperkte bioindicator-fenotype in het wildtype.
Wild-type culturen in de stationaire fase gekweekt in ZLM met een beperkte hoeveelheid Zn2+ zijn verlengd met een gemiddelde cellengte van ongeveer 9 µm, terwijl Zn2+-verzadigde culturen gekweekt in ZRM kort zijn met een gemiddelde cellengte van ongeveer 3 µm (Figuur 1B). Wild-type culturen gekweekt in ZLM met Zn2+-contaminatie (ZLM-C) verlengen niet volledig, maar zijn iets langer dan Zn2+-verzadigde cellen met een gemiddelde cellengte van 5 µm. Bio-indicatie van Zn2+-contaminatie in volledige batches ZLM duidt op mogelijke contaminatie tijdens de bereiding, terwijl contaminatie in individuele culturen (d.w.z. kolven) duidt op contaminatie door onjuist wassen van kolven of cultuurbereiding. Wild-type culturen gekweekt in ZLM die ernstig uitgeput zijn van Zn2+ (ZLM-D) vertonen een minder uitgesproken verlenging met een gemiddelde cellengte van ongeveer 7 µm (Figuur 1B). Het verlengde wild-type fenotype wordt niet waargenomen bij de ΔaltRP-stam, en ΔaltRP-cellen met een beperkte hoeveelheid Zn2+ hebben een gemiddelde cellengte van ongeveer 5 µm (Figuur 1B). Figuur 2 toont representatieve afbeeldingen van cellen gekweekt in verschillende bereidingen van ZLM of ZRM (na stap 2) en gevisualiseerd met een samengestelde lichtmicroscoop. Na stap 4 worden cellen uit talrijke velden in afbeeldingen zoals getoond in Figuur 2 gebruikt om de gemiddelde cellengte van de culturen in Figuur 1B te berekenen. Het verlengde wild-type fenotype is specifiek voor Zn2+-beperkende condities; cellulaire verlenging wordt niet waargenomen wanneer culturen Zn2+-verzadigd of ernstig Zn2+-uitgeput zijn (Figuur 1B en Figuur 2).
Het fenotype van de bio-indicator met verminderde F420-fluorescentie wordt het best waargenomen in fluorescentiescans (Figuur 1C). De verminderde fluorescentie van cofactor F420 wordt gekwantificeerd door het percentage fluorescentie-intensiteit bij 375 nm (achtergrond) ten opzichte van 420 nm (autofluorescentie van cofactor F420) te bepalen zoals beschreven in stap 3.16.5, weergegeven als F375/420. Voor monochromatische platenlezers zonder fluorescentiescan-mogelijkheid zijn puntmetingen bij 375 nm en 420 nm (beide met emissie bij 475 nm) geschikt om F375/420 te berekenen. Wildtype-culturen gekweekt onder Zn2+-verzadigde condities (d.w.z. in ZRM) vertonen een zeer reproduceerbare F375/420 van rond de 17% (Figuur 1D). Een afname van de F420-fluorescentie in Zn2+-beperkte culturen gekweekt in ZLM wordt gekenmerkt door een stijging van de F375/420 naar ongeveer 27% (Figuur 1D). De F420-fluorescentie in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam is opvallend lager dan die van het wildtype onder dezelfde conditie, en dit is visueel duidelijk zichtbaar in fluorescentiescans (Figuur 1C). De F375/420 is variabeler in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam, met een bereik van ongeveer 50%-80% (Figuur 1D). Culturen gekweekt in ZLM die bio-indicatie van Zn2+-contaminatie vertonen (ZLM-C) hebben een verlaagde F375/420 van rond de 21%, en culturen die Zn2+-uitgeput zijn (ZLM-D) hebben een F375/420 van rond de 35% (Figuur 1D).
Samenvattend moeten drie bioindicator-fenotypes worden beoordeeld in de wild-type en ΔaltRP-stammen om de Zn2+-beperkte status van culturen gekweekt in ZLM te verifiëren. Voor biologisch relevante Zn2+-beperkende groei moeten de bioindicatoren als volgt zijn: [1] de OD600 van het wild-type is 3,5 - 5, en de ΔaltRP-stam is minder dan 3, [2] wild-type cellen zijn ongeveer 10 µm lang, en ΔaltRP-cellen zijn half zo lang, en [3] F375/420 van de ΔaltRP-stam is hoog, d.w.z. boven de 50%.
Bioindicator-fenotypes van M. tuberculosis 
Zn2+-beperkte M. tuberculosis vertoont niet hetzelfde morfogene programma als M. smegmatis. In het bijzonder is er geen verschil in de OD600 tussen Zn2+-verzadigde en Zn2+-beperkte culturen, en Zn2+-beperkte culturen vertonen geen duidelijk morfologisch fenotype; ze worden dus niet langer23. Evenzo is er bij M. tuberculosis geen Zn2+-gedepleteerd bioindicator-fenotype (d.w.z. een verminderde celdichtheid) zoals wel wordt waargenomen bij M. smegmatis. Zn2+-beperkte culturen vertonen meer duidelijke klontervorming in vergelijking met Zn2+-verzadigde culturen, hoewel beide condities op dag 10 aanzienlijk klonterig zijn (waargenomen in zowel Mtb-H37Rv als Mtb-Aux). Het belangrijkste bioindicator-fenotype voor Zn2+-beperking in M. tuberculosis is een verminderde piek-F420-fluorescentie, zoals eerder gerapporteerd23. De resultaten voor culturen die 8 dagen zijn gegroeid, worden hier gepresenteerd in plaats van 10 dagen om klontervorming te minimaliseren. Verminderde F420-fluorescentie is zichtbaar in Zn2+-beperkte culturen met zowel monochromatische (Figuur 3) als filtergebaseerde plaatlezers. Bij filtergebaseerde plaatlezers met gebruik van Mtb-H37Rv hebben Zn2+-beperkte culturen (d.w.z. gegroeid in ZLM) ongeveer 50% van de ruwe fluorescentiewaarden van Zn2+-verzadigde culturen (d.w.z. gegroeid in ZRM; gegevens niet getoond). Met een monochromatische plaatlezer in bottom-reading modus en Mtb-Aux hebben Zn2+-verzadigde culturen een F375/420 van rond de 75%, en Zn2+-verontreinigde ZLM-culturen hebben vergelijkbare waarden. De verminderde F420-fluorescentie in Zn2+-beperkte culturen gegroeid in ZLM wordt weerspiegeld door een F375/420 van meer dan 100%. De Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam vertoont een vergelijkbare groei en F420-fluorescentie als waargenomen bij het Zn2+-beperkte wild-type (Figuur 3) en is niet bruikbaar als bioindicator in M. tuberculosis zoals dat wel het geval is in M. smegmatis (Figuur 1). Daarom is het raadzaam om media die gebruikt zullen worden voor de kweek van M. tuberculosis eerst te testen met de snelgroeiende M. smegmatis.
<img alt="Groeicurves, lengteverdeling en fluorescentieanalyse in bacteriële studie; grafieken en boxplots." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Bioindicator-fenotypes van M. smegmatis gekweekt onder Zn2+-beperking en het effect van Zn2+-contaminatie en Zn2+-depletie op de fenotypes. Representatieve voorbeelden van het bioindicator-fenotype in elk paneel zijn afkomstig van dezelfde culturen na 72 u. Voorbeelden van Zn2+-gecontamineerde (ZLM-C), Zn2+-beperkte (ZLM-L) en Zn2+-gedepleteerde (ZLM-D) groeiresultaten zijn afkomstig van onafhankelijke mediapreparaties die allemaal volgens dezelfde hier gepresenteerde bereidingsmethode zijn uitgevoerd (stap 2). De representatieve fenotypes voor de Zn2+-beperkte wild-type en ΔaltRP-stammen zijn afkomstig uit dezelfde batch ZLM. Alle stammen en condities hebben drie biologische replica's (n=3). (A) Groeicurves die de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) tonen en de afnemende celdichtheid bij Zn2+-beperking en -depletie. Foutenbalken representeren de standaarddeviatie tussen de replica's. (B) Cellengtes van wild-type en ΔaltRP-stammen die het verlengde fenotype van Zn2+-beperkt wild-type aantonen. De boxplot toont het interkwartielafstand, minimum, maximum en de mediane cellengte in µm. (C) Representatieve fluorescentiescans van culturen die een verlaagde piek in F420-fluorescentie tonen bij Zn2+-beperking en een verminderde F420-fluorescentie in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam. Er wordt slechts één representatieve cultuur uit de biologische triplicaten van elk van de verschillende mediapreparaties getoond. Fluorescentiescans maken gebruik van een excitatiegolflengtebereik van 230 nm tot 440 nm met een stapgrootte van 5 nm en een emissiegolflengte van 475 nm. Het inzetstuk linksboven is een ingezoomd beeld van de Zn2+-beperkte wild-type en ΔaltRP-stammen om de verlaagde fluorescentiepiek bij 420 nm in de Zn2+-beperkte ΔaltRP-stam te accentueren. De as-eenheden zijn gelijk aan die van de hoofdgrafiek. Alle legenda's zijn gelijk aan die in (A). (D) Kwantificatie van de verminderde fluorescentie van cofactor F420, berekend uit het percentage F375/420. Percentages zijn berekend uit de waarden verkregen uit de fluorescentiescans in (C). De boxplot toont het interkwartielafstand, minimum, maximum en de mediane percentages. Afkortingen die de Zn2+-relevante status van het medium representeren en tussen haakjes na het mediatype staan zijn R = Zn2+-verzadigd, C = Zn2+-gecontamineerd, L = Zn2+-beperkt en D = Zn2+-gedepleteerd; overige afkortingen zijn: WT = wild-type stam, a.u. = arbitraire eenheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Resultaten van Zn²⁺-status elektroforese, WT vs ΔaltRP, eiwitscheidingsanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2: Representatieve microscopiebeelden van M. smegmatis na 72 u. De afbeeldingen zijn afkomstig van de culturen die worden getoond in Figuur 1. De cellen zijn gefotografeerd met een samengestelde lichtmicroscoop bij een totale vergroting van 1000x met gebruik van een 100x olie-immersielens. De schaalbalken zijn 10 µm. Afkortingen die de Zn2+-relevante status van het medium weergeven en tussen haakjes na het mediumtype staan, zijn: R = Zn2+-verzadigd, C = Zn2+-gecontamineerd, L = Zn2+-beperkt en D = Zn2+-uitgeput; overige afkortingen zijn: WT = wildtype-stam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Grafiek van het fluorescentie-excitatiespectrum; golflengte versus fluorescentie; proteïne-studie analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3: Verlies van het F420 bio-indicatorfenotype in Zn2+-beperkte M. tuberculosis, aangetoond door representatieve fluorescentiescans van auxotrof Mtb mc26206 (Mtb-Aux).Voorbeelden van Zn2+-gecontamineerde en Zn2+-beperkte groeiresultaten zijn afkomstig van onafhankelijke mediumbereidingen. De Zn2+-beperkte wild-type en ΔaltRP stammen zijn afkomstig van dezelfde batch ZLM. Alle stammen en condities hebben drie biologische replica's (n=3). In de grafiek is slechts één representatieve cultuur van de biologische triplicaten uit elk van de verschillende mediumbereidingen en stammen weergegeven. Fluorescentiescans zijn uitgevoerd in de bottom-reading modus na 8 dagen groei, gebruikmakend van een excitatiegolflengtebereik van 230 nm tot 440 nm met een stapgrootte van 5 nm en een emissiegolflengte van 475 nm. Afkortingen die de Zn2+-relevante status van het medium weergeven en tussen haakjes achter het mediumtype staan, zijn: R = Zn2+-replete, C = Zn2+-gecontamineerd, L = Zn2+-beperkt en D = Zn2+-uitgeput; overige afkortingen zijn: WT = wild-type stam, a.u. = arbitraire eenheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de bereiding van Zn2+-beperkte media, kweekvaten en zaaikulturen om Zn2+-beperkte ribosomen in mycobacteriën te produceren. Sporen van Zn2+ leiden tot Zn2+-beperkte groei en we beschrijven morfogene eigenschappen die als bio-indicatoren worden gebruikt om Zn2+-beperking in vitro te verifiëren in het modelbacterie, Mycobacterium smegmatis, en de humane pathogeen M. tuberculosis.

Gebruik van Mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

using-mycobacterium-smegmatis-as-bioindicator-for-zinc-limited-growth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

Source: Gupta, S., et al. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for culturing Mycobacterium tuberculosis under iron-limited conditions to induce iron stress and promote the secretion of siderophores that support bacterial survival.

Culturing Mycobacterium tuberculosis Under Iron-Limited Conditions

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het ontwikkelen van pellicle biofilm. De methode is schaalbaar naar verschillende kweekvolumes, waardoor ze gemakkelijk kunnen worden toegepast voor verschillende experimentele doeleinden. Het ontwerp van de methode maakt een kwalitatieve of kwantitatieve beoordeling van het biofilmvormend potentieel van verschillende mycobacteriële soorten mogelijk.

Mycobacteriële biofilm kweken als model om antimicrobiële resistentie te bestuderen

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

CD4 + T-lymfocyten Capture Met behulp van een Wegwerp Microfluïdische Chip voor HIV

Mycobacteriële pathogene strategieën blijven slecht begrepen. De langzame groei van de meeste soorten, de ondoordringbare karakter van de cel-wand, en de gevaren van het werken met pathogenen maken mycobacteriën moeilijk om te studeren en zijn grotendeels verantwoordelijk voor onze slechte begrip van deze organismen. In deze video laten we zien de techniek van elektroporatie, die onderwerpen cellen gaat om een ​​korte hoge elektrische impuls om de toegang van het DNA. Het is de meest gebruikte...

Elektroporatie van mycobacteriën

Ontdek hoe Mycobacterium smegmatis dient als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën. Deze methode maakt gestandaardiseerde productie van translationeel actieve ribosomen mogelijk.

Gebruik van Mycobacterium smegmatis als bio-indicator voor zink-beperkte groeiomstandigheden in mycobacteriën

Meer video's verkennen