Name: CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Leer CRISPR-Cas9 gendeletie in menselijke embryonale stamcellen met lentivirale transductie. Deze methode behoudt pluripotentie en differentiatiepotentieel voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+structures+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 structures and mechanisms.</a> Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome-editing+system+in+human+stem+cells%3A+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+regulation+of+D2HGDH+and+L2HGDH+influences+the+epigenome+and+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome.</a> Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).</li>
<li>Sheikh, M. A., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+delivery+of+shRNAs+to+hESCs+and+NPCs+using+low-cost+cationic+polymer+polyethylenimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI).</a> J Vis Exp. (183), e63953(2022).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+for+screening+of+CRISPR%2FCas9-induced+homozygous%2Fbiallelic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants.</a> Plant Methods. 14 (1), 40(2018).</li>
<li>Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+alters+embryonic+cortical+neurogenesis+through+modulation+of+gene+expression+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells.</a> J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation.</a> Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensitive+protein+O-GlcNAcylation+modulates+the+transcriptome+through+epigenetic+mechanisms+during+embryonic+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis.</a> Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modeling+of+hepatogenesis+using+obese+iPSCs-hepatocyte+differentiation+uncovers+pathological+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features.</a> Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+hepatocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor.</a> Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).</li>
<li>Jacobs, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+na%C3%AFve+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).</li>
<li>Cuevas-Ocaña, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+optimized+approach+for+rapid+and+efficient+gene+editing+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN-targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem cell technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Recombinant human</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Stem cell technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM NUTRIENT MIX F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca and Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovie serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta;&nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stem cell technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100x Solution</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINE, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Polyclonal antibody</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 complete media</td><td>Stem cell technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Antibody</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Supplement 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Supplement 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Antibody</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene infection reagent</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, branched</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus Titer Kit</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrochloride&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 Antibody</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN.05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

crispr-cas9-mediated-gene-deletion-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Hier wordt beschreven, is een protocol voor tagging endogeen uitgedrukt eiwitten met fluorescerende codes in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9. Vermoedelijk bewerkte cellen zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cel Sorteren en klonen cellijnen worden gegenereerd.

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Het volgende protocol bevat instructies voor het aanpassen van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan feeder-vrije cultuur met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (KSR-FF). Een keer aangepast, instructies voor de voortdurende onderhoud zijn ook aanwezig.

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Leer CRISPR-Cas9 gendeletie in menselijke embryonale stamcellen met lentivirale transductie. Deze methode behoudt pluripotentie en differentiatiepotentieel voor regeneratieve geneeskunde.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Meer video's verkennen