Name: Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Leer de assemblage en kwantificering van co-culturen met suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gist. Dit protocol optimaliseert sucroseproductie en monitort microbieel netwerken voor biotechnologische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protocol voor het co-kweken van sucrose-afscheidende cyanobacteriën met schimmelpartners

<table><tbody><tr><td>10x Ph1 objective</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Bandpass Filter</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>FITC filter (in 488 nm laser)</td></tr><tr><td>660/10 nm Bandpass Filter</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>APC kanaal (in 638 nm laser)</td></tr><tr><td>710/50 nm Bandpass Filter</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 kanaal (in 561 nm laser)</td></tr><tr><td>Accuvettes for Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Stalen bekers met deksels</td></tr><tr><td>Aperture tube 30 μM for Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td>Capillair</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>voor sterilisatie van materiaal</td></tr><tr><td>Baffled flasks ROTILABO®, Straight neck, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 componenten</td><td>verschillende leveranciers</td><td></td><td>zie Tabel 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Flesstop steriele filter</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>voor steriele media als u geen autoclaaf wilt gebruiken</td></tr><tr><td>Capillair 45 μm</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter Model TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY cups</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Reinigingsoplossing</td></tr><tr><td>CASYton oplossing</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Isotone oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>voor de toevoer van axenische cyanobacteriële culturen en co-culturen</td></tr><tr><td>CONTRAD® 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Diep reinigende oplossing</td></tr><tr><td>Dekglas 20 × 26 x 0.4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Dekglas voor tellingskamer</td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cyanobacteria BG-11 Freshwater Solution</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Cytometer-applicatiesoftware</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>Sheathvloeistof</td></tr><tr><td>Cytometer CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>BE51180</td><td></td></tr><tr><td>DxH Cleaner for Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Reinigingsoplossing</td></tr><tr><td>Eppendorfbuis centrifuge (klein)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>voor centrifugeren van minder dan 2mL van een kweek</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS buizen</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>buizen voor semi-automatische modus</td></tr><tr><td>Gradeercilinders</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>voor bereiding van media</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron foto-incubator</td><td>Infors AG</td><td></td><td>witte LED verlichting</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Maak aliquots aan, bewaar bij -20&deg;C, ontdooi en houd op ijs&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoton II voor Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Isotone oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Cytometrie dataanalysesoftware</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Lintvrije zakdoekjes</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Maatbekers</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Micro test plaat, 96 well, slip-on deksel, platte basis, PS, transparant</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop basis</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop hoofd</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q waterzuiveringssysteem</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4e deeltjesteller</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternatief voor de CASY Cell Counter</td></tr><tr><td>Neubauer verbeterd, diepte 0.02 mm</td><td>Assistent Germany</td><td></td><td>Tellenkamer</td></tr><tr><td>Neubauer verbeterd, diepte 0.1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Tellenkamer</td></tr><tr><td>Ready to Use Daily QC Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Referentie voor QC</td></tr><tr><td>SCHOTT flessen</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>voor opslag</td></tr><tr><td>Specord®200 Plus Spectrophotometer</td><td>Analytic Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel (groot)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>Kweekbiomassa verzamelen</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base, zonder aminozuren, zonder ammoniumsulfaat</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>11743014</td><td></td></tr></tbody></table>

assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Ons onderzoek is gericht op het begrijpen van microbiële netwerken in synthetische consortia die sucrose-uitscheidende cyanobacteriën en heterotrofe schimmels omvatten. In het verleden bestudeerden microbiologen meestal zuivere culturen van enkele micro-organismen. In de natuur komen microben echter meestal voor in consortia, en daarom is het essentieel om ook microbiële netwerken in gemengde culturen te begrijpen.Een grote uitdaging is het vinden van geschikte groeiomstandigheden, inclusief een medium dat groei van alle consortia-leden mogelijk maakt. Hier richten we ons voornamelijk op het optimaliseren van de hoogste sucroseproductie en secretie door het fototrofe lid, wat de basis vormt voor de groei van de heterotrofe leden. Voor het volgen van groei in axenische culturen kunnen gebruikelijke technieken zoals optische dichtheid of backscattermetingen worden gebruikt.Deze technieken zijn echter niet van toepassing op co-culturen waarbij we de celtelling van de individuele soorten nodig hebben. In ons protocol gebruiken we een combinatie van fluorescente markering en celtelling om onderscheid te maken tussen verschillende co-cultuurpartners. Daarnaast konden we aantonen dat vergelijkbare resultaten kunnen worden bereikt door verschillende methoden, variërend van eenvoudige, goedkope tot dure, hoogdoorvoerige methoden.Om te beginnen, pellet de cyanobacteriële cellen na het laten groeien van de cultuur gedurende drie dagen. Resuspendeer de pellet in 25 milliliter steriel CoYBG-11-medium. Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij 4.000g op kamertemperatuur.Gooi vervolgens het supernatant weg door te decanteren. Zodra de optische dichtheid is bepaald, voegt u de berekende hoeveelheid CoYBG-11 toe in een 250-milliliter baffled kolf onder steriele omstandigheden. Voeg vervolgens de berekende volumes van de cyanobacteriële en heterotrofe celsuspensies toe om een ​​uiteindelijk cultuurvolume van 50 milliliter te bereiken.Gebruik 50 microliters van de een-molar IPTG-stock voor een 50-milliliter cultuur. Plaats vervolgens de kolf in de foto-incubator op ongeveer 200 micromol fotonen per vierkante meter per seconde. Vul het milieu aan met 2% koolstofdioxide bij 30 graden Celsius, orbitaal schudden bij 150 RPM en 75% vochtigheid.Voor bemonstering, haal de kolf uit de incubator en neem onder steriele omstandigheden een monster van één milliliter uit de cultuur. Om voor te bereiden op de microscopische kwantificering, zorg ervoor dat de tellingskamer en het dekglaasje vrij zijn van stof en cellen. Plaats het dekglaasje correct door het met een beetje druk op de twee steunstaven te schuiven terwijl u breuk vermijdt.Zodra het dekglaasje goed is gepositioneerd, observeer Newton's ringen tussen de twee glasoppervlakken terwijl u ervoor zorgt dat het dekglaasje niet wegglijdt. Meng nu de celsuspensie grondig en breng een paar microliters aan op de rand van de kamer. Laat de kamer volledig vullen via capillaire kracht.Gebruik vervolgens een geschikt objectief van een lichtmicroscoop en focus op de rasterlijnen van de tellingskamer. Tel de cellen in de vierkanten die geschikt zijn voor de gegeven celgrootte. Voor kwantificering door deeltjestelling, pas de optische dichtheid van het monster aan op 0,1.Voeg vervolgens 10 microliters van het monster toe aan 10 milliliter isotone meetbuffer. Zet het deksel van de monstercup vast en meng het monster voorzichtig door de cup lichtjes te kantelen. Nadat de monstercup in de deeltjesteller is geplaatst, steekt u een capillair met de juiste poriegrootte voor de gebruikte cellen in de monstercup en sluit de deur van de machine.Start de meting en neem op in een geschikt bereik. Cellen met verschillende celgroottes kunnen in dit stadium worden onderscheiden. Voor kwantificering door flowcytometrie met één cel, pas de optische dichtheid van de monsters aan om een ​​geschikte rangschikking voor cytometriemetingen te regelen.Gebruik de gegeven formule om ervoor te zorgen dat de celtelling binnen een bereik van 1.000 tot 10.000 cellen per seconde blijft bij een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut. Breng 300 microliters van elke monstercelsuspensie over naar een afzonderlijke put in een 96-wellsplaat. Breng vervolgens de 96-wellsplaat over naar de automatische monster van de cytometer.Open puntdiagrammen en histogrammen voor de fluorescentie- en verstrooiingskanalen die relevant zijn voor de monsters. Om de celconcentratie te bepalen, neemt u een gedefinieerd monstervolume op met behulp van de opnamefunctie. Scheid de signalen voor foto- en heterotrofe organismen op basis van de rode autofluorescentie van het fototrofe organisme met behulp van het histogram van het APC-H-kanaal.Gebruik vervolgens het histogram van het FITC-H-kanaal dat alleen de heterotrofe populatie weergeeft om de heterotrofe cellen met groen fluorescerend eiwit te identificeren. Gebruik het histogram van het PC5.5-H-kanaal om onderscheid te maken tussen heterotrofe cellen die rood fluorescerend eiwit bevatten en diegene die dat niet doen.

assembly-quantification-co-cultures-combining-heterotrophic-yeast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Jiang, H., Ho, M. Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria. J. Vis. Exp.(2021).This video demonstrates the procedure for culturing cyanobacteria to obtain biomass by growing cells under continuous illumination with carbon dioxide supply and nutrient-rich conditions, followed by harvesting via centrifugation.

Preparation of Cyanobacterial Culture for Biomass Production

We ontwierpen een continu kweken inrichting voor gebruik met systemen optogenetic aan kweken van microben en regelmatig afbeeldingscellen branden in het effluent met een omgekeerde microscoop. Het kweken, sampling, beeldvorming en beeldanalyse zijn volledig geautomatiseerd, zodat dynamische reacties op de verlichting kan worden gemeten over meerdere dagen.

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van fycobilisomen uit cyanobacteriën door centrifugering door middel van een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt. De fracties van intacte fycobilisomen worden bevestigd door 77K fluorescerend emissiespectrum en SDS-PAGE-analyse. De resulterende fycobilisoomfracties zijn geschikt voor negatieve kleuring van TEM en massaspectrometrie-analyse.

Isolatie en karakterisering van intact fycobilisoom in cyanobacteriën

In deze studie was het belangrijkste doel om de cellulaire opname en uiteindelijke exocytose van koolstofnanobuizen (CNT's) te monitoren. Vanuit dit perspectief stelden we hier een unieke methode voor die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming en stromende cytometrie, waardoor een kwantificering en lokalisatie van CNT's in een statistisch relevant aantal cellen mogelijk is.

Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie

Werkwijze voor nanovezels en complexe nanostructuren verkrijgen uit een of meerdere extracellulaire matrixeiwitten beschreven. Deze methode maakt gebruik van proteïne-oppervlak interacties vrijstaande eiwit gebaseerde materialen maken met instelbare samenstelling en architectuur voor gebruik in een verscheidenheid van tissue engineering en biotechnologische toepassingen.

ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.

Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Leer de assemblage en kwantificering van co-culturen met suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gist. Dit protocol optimaliseert sucroseproductie en monitort microbieel netwerken voor biotechnologische toepassingen.

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Meer video's verkennen