Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Ons onderzoek is gericht op het begrijpen van microbiële netwerken in synthetische consortia die sucrose-uitscheidende cyanobacteriën en heterotrofe schimmels omvatten. In het verleden bestudeerden microbiologen meestal zuivere culturen van enkele micro-organismen. In de natuur komen microben echter meestal voor in consortia, en daarom is het essentieel om ook microbiële netwerken in gemengde culturen te begrijpen.

Een grote uitdaging is het vinden van geschikte groeiomstandigheden, inclusief een medium dat groei van alle consortia-leden mogelijk maakt. Hier richten we ons voornamelijk op het optimaliseren van de hoogste sucroseproductie en secretie door het fototrofe lid, wat de basis vormt voor de groei van de heterotrofe leden. Voor het volgen van groei in axenische culturen kunnen gebruikelijke technieken zoals optische dichtheid of backscattermetingen worden gebruikt.

Deze technieken zijn echter niet van toepassing op co-culturen waarbij we de celtelling van de individuele soorten nodig hebben. In ons protocol gebruiken we een combinatie van fluorescente markering en celtelling om onderscheid te maken tussen verschillende co-cultuurpartners. Daarnaast konden we aantonen dat vergelijkbare resultaten kunnen worden bereikt door verschillende methoden, variërend van eenvoudige, goedkope tot dure, hoogdoorvoerige methoden.

Om te beginnen, pellet de cyanobacteriële cellen na het laten groeien van de cultuur gedurende drie dagen. Resuspendeer de pellet in 25 milliliter steriel CoYBG-11-medium. Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij 4.000g op kamertemperatuur.

Gooi vervolgens het supernatant weg door te decanteren. Zodra de optische dichtheid is bepaald, voegt u de berekende hoeveelheid CoYBG-11 toe in een 250-milliliter baffled kolf onder steriele omstandigheden. Voeg vervolgens de berekende volumes van de cyanobacteriële en heterotrofe celsuspensies toe om een ​​uiteindelijk cultuurvolume van 50 milliliter te bereiken.

Gebruik 50 microliters van de een-molar IPTG-stock voor een 50-milliliter cultuur. Plaats vervolgens de kolf in de foto-incubator op ongeveer 200 micromol fotonen per vierkante meter per seconde. Vul het milieu aan met 2% koolstofdioxide bij 30 graden Celsius, orbitaal schudden bij 150 RPM en 75% vochtigheid.

Voor bemonstering, haal de kolf uit de incubator en neem onder steriele omstandigheden een monster van één milliliter uit de cultuur. Om voor te bereiden op de microscopische kwantificering, zorg ervoor dat de tellingskamer en het dekglaasje vrij zijn van stof en cellen. Plaats het dekglaasje correct door het met een beetje druk op de twee steunstaven te schuiven terwijl u breuk vermijdt.

Zodra het dekglaasje goed is gepositioneerd, observeer Newton's ringen tussen de twee glasoppervlakken terwijl u ervoor zorgt dat het dekglaasje niet wegglijdt. Meng nu de celsuspensie grondig en breng een paar microliters aan op de rand van de kamer. Laat de kamer volledig vullen via capillaire kracht.

Gebruik vervolgens een geschikt objectief van een lichtmicroscoop en focus op de rasterlijnen van de tellingskamer. Tel de cellen in de vierkanten die geschikt zijn voor de gegeven celgrootte. Voor kwantificering door deeltjestelling, pas de optische dichtheid van het monster aan op 0,1.

Voeg vervolgens 10 microliters van het monster toe aan 10 milliliter isotone meetbuffer. Zet het deksel van de monstercup vast en meng het monster voorzichtig door de cup lichtjes te kantelen. Nadat de monstercup in de deeltjesteller is geplaatst, steekt u een capillair met de juiste poriegrootte voor de gebruikte cellen in de monstercup en sluit de deur van de machine.

Start de meting en neem op in een geschikt bereik. Cellen met verschillende celgroottes kunnen in dit stadium worden onderscheiden. Voor kwantificering door flowcytometrie met één cel, pas de optische dichtheid van de monsters aan om een ​​geschikte rangschikking voor cytometriemetingen te regelen.

Gebruik de gegeven formule om ervoor te zorgen dat de celtelling binnen een bereik van 1.000 tot 10.000 cellen per seconde blijft bij een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut. Breng 300 microliters van elke monstercelsuspensie over naar een afzonderlijke put in een 96-wellsplaat. Breng vervolgens de 96-wellsplaat over naar de automatische monster van de cytometer.

Open puntdiagrammen en histogrammen voor de fluorescentie- en verstrooiingskanalen die relevant zijn voor de monsters. Om de celconcentratie te bepalen, neemt u een gedefinieerd monstervolume op met behulp van de opnamefunctie. Scheid de signalen voor foto- en heterotrofe organismen op basis van de rode autofluorescentie van het fototrofe organisme met behulp van het histogram van het APC-H-kanaal.

Gebruik vervolgens het histogram van het FITC-H-kanaal dat alleen de heterotrofe populatie weergeeft om de heterotrofe cellen met groen fluorescerend eiwit te identificeren. Gebruik het histogram van het PC5.5-H-kanaal om onderscheid te maken tussen heterotrofe cellen die rood fluorescerend eiwit bevatten en diegene die dat niet doen.