Co-cultuurmodel met behulp van twee soorten hechtende cellijnen

Zoals de naam van onze instelling, Maternal-Fetal Medicine Institute, suggereert, richt ons onderzoek zich voornamelijk op vrouwelijke reproductieve biologie. We streven ernaar het mechanisme van voortplantingsstoornissen te begrijpen en potentiële doelwitten voor de behandeling ervan te identificeren. Een belangrijk voordeel van deze aanpak is de aanzienlijke vermindering van tijd en kosten in vergelijking met commercieel beschikbare co-cultuursystemen.

De zelfgemaakte steiger is gemaakt van gemakkelijk verkrijgbare materialen, waardoor de kosten van de installatie aanzienlijk worden verlaagd. Deze multi-cel in vitro modellen geven een complexe in vivo anatomie van het implantatiegebied beter weer. In de toekomst zal ons laboratorium andere celtypen introduceren in dit gemengde seeding multi-cell in vitro model, en meer onderzoek doen naar zowel implantatiestudies als de baarmoederfunctie in de pathogenese van ziekten zoals endometriumletsel en intra-uteriene hechting.

Verkrijg om te beginnen de 3D-geprinte steiger voor modelbouw. Plaats voor celcultuur een schoon en steriel vierkant dekglaasje van 18 millimeter op de bodem van een plaat met 12 putjes. Smeer het dekglaasje in met 200 microliter extracellulaire matrix in een concentratie van 200 tot 300 microgram per milliliter.

Bewaar de plaat een uur op 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de extracellulaire matrix van de plaat. Inspecteer vervolgens de eerder gekweekte menselijke embryonale stamcellen en Ishikawa-cellen onder een microscoop om de juiste samenvloeiing te bevestigen.

Verwijder vervolgens het gebruikte medium uit de putjes en was de cellen twee keer met drie milliliter PBS. Incubeer de cellen nu met twee milliliter dissociatie-enzym bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten om ze los te maken. Neutraliseer de reactie met behulp van een compleet kweekmedium.

Maak vervolgens een eencellige suspensie door op en neer te pipetteren. Meng nu 100 microliter van de celsuspensie met trypanblauw, met behoud van een verdunningsfactor van twee. Schuif vervolgens het dekglaasje over de hemocytometerkamer.

Vul beide zijkamers met de celsuspensie gemengd met trypanblauw. Tel het aantal cellen in vierkanten aan beide zijden onder een 20X-microscoop en bereken de celdichtheid op basis van de tellingen. Zaai nu de menselijke embryonale stamcellen in een concentratie van 10 tot de macht van vijf cellen per milliliter in de voorbereide plaat met vers medium, en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.

Voor de Ishikawa-cellijn zaait u de cellen de volgende dag zonder dekglaasje in het putje. Week de steigers twee dagen grondig met ethylalcohol en dubbel gedestilleerd water. Verwijder na het weken het dubbel gedestilleerde water en sluit het metalen blik af.

Steriliseer de steigers vervolgens met behulp van een autoclaaf bij 121 graden Celsius. Laat ze daarna drogen. Voeg ongeveer twee milliliter complementair medium toe aan het putje met de Ishikawa-cellen.

Breng het dekglaasje met aangehechte menselijke embryonale stamcellen over op de steiger en plaats de celzijde naar beneden. Sluit de steiger aan op de put met Ishikawa-cellen. Voor de tweede opstelling plaatst u het dekglaasje met Ishikawa-cellen op de steiger en steekt u het in het putje met embryonale stamcellen.

Incubeer de co-cultuursystemen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verwijder voorzichtig het kweekmedium uit de putjes en spoel de cellen voorzichtig af met steriel PBS. Verwijder met een fijne tang of pincet de dekglaasjes met aangehechte cellen van de kweekschalen.

Plaats de dekglaasjes eventueel in een nieuwe schaal met PBS om ze gehydrateerd te houden tijdens het overdrachtsproces. Voeg een druppel PBS toe op een schoon microscoopglaasje en breng het dekglaasje met de cellen voorzichtig over op de druppel, zorg ervoor dat de cellen met de bedrukte zijde naar beneden op het objectglaasje liggen. Plaats het voorbereide objectglaasje op de tafel van een omgekeerde microscoop.

Selecteer de juiste objectieflens en gebruik de grove en fijne scherpstelknoppen om de scherpstelling aan te passen. Stel microscoopparameters in, waaronder de intensiteit van de verlichting en camera-instellingen. Gebruik de microscoopsoftware om beelden vast te leggen met de gewenste vergrotingen en gezichtsvelden.

De dichtheid van beide celtypen bleef na 72 uur laag in de co-cultuurconditie, terwijl de onafhankelijk gekweekte celdichtheden aanzienlijk toenamen. De lengte van co-gekweekte menselijke embryonale stamcellen was korter dan die van onafhankelijke cellen.