Isolatie en opname van patch-clamp met hele cellen van hippocampale microglia van volwassen muizen

Ons onderzoek richt zich op het acuut isoleren van microglia voor opnames van hele cellen, inclusief kaliumstromen om de ionkanaalactiviteit te begrijpen. Het protocol is ook aanpasbaar voor het isoleren van microglia voor verschillende hersengebieden, waardoor inzicht wordt verkregen in nul in verschillende neurologieaandoeningen.

De meest recente ontwikkelingen in ons onderzoeksveld zijn onder meer het gebruik van traditionele pancreatitis enzymdigestie, gecombineerd met microglia-zuivering door middel van fluorescentie actieve celsortering. Deze ontwikkelingen hebben de nauwkeurigheid en efficiëntie van het isoleren van specifieke microglia-populaties voor verder onderzoek verbeterd.

Ons protocol onderzoekt de elektrofysiologische eigenschappen van microglia rechtstreeks van de hippocampus van volwassen muizen, in plaats van te vertrouwen op primair gekweekte CS. Deze aanpak maakt een nauwkeurigere analyse van microglia-functies in hun oorspronkelijke omgeving mogelijk.

Onze resultaten hebben de weg vrijgemaakt voor nieuwe wetenschappelijke vragen over de biochemische en functionele eigenschap van microglia onder zowel fysiologische als ziekteomstandigheden, en bieden onderzoekers waardevolle begeleiding bij het verder onderzoeken van deze aspecten.

[Presentator] Leg om te beginnen het verdoofde dier in rugligging op een snijtafel en speld hun ledematen vast. Stel de borstkas bloot en doordrenk het hart met ijskoude, steriele PBS om intravasculaire circulerende bloedcellen te verwijderen. Houd vervolgens het hoofd vast en knip de huid langs de middellijn van de hersenen met een schaar om de schedel bloot te leggen. Knip vervolgens de achterkant van de schedel bilateraal en tussen de oogkassen af met een kleine schaar. Snijd de schedel langs de sagittale hechting en verwijder de schedel met een pincet. Haal daarna snel het hersenweefsel eruit. Plaats nu het hersenweefsel in kweekschaaltjes van 10 centimeter met ijskoude PBS. Ontleed de hersenschors bilateraal met een pincet. Isoleer het weefsel van de hippocampus en snijd het in kleinere stukjes. Breng de stukjes over in een centrifugebuis van 15 milliliter. Suspendeer vervolgens de kleine stukjes hippocampusweefsel opnieuw in twee milliliter ijskoude Hanks' Balanced Salt Solution of HBSS. En centrifugeer bij 300 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, voegt u 1.950 microliter enzymmengsel toe aan de centrifugebuis van 15 milliliter die de stukjes hippocampusweefsel bevat. Schud de centrifugebuis continu in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 30 microliter vers bereid enzymmengsel twee toe aan de centrifugebuis van 15 milliliter. Pipetteer de weefselfragmenten 20 keer op en neer met een pipetpunt van één milliliter en incubeer gedurende vijf minuten in een waterbad onder continu schudden bij 37 graden Celsius. Na het verwijderen van de centrifugebuis, pipetteer je de suspensie meerdere keren op en neer met een pipet van één milliliter totdat er geen grote stukjes weefsel meer over zijn. Filtreer vervolgens de celsuspensie door een 70 micrometer celzeeffilter en vang het filtraat op in een schone centrifugebuis van 50 milliliter. Breng het filtraat over in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 G bij vier graden Celsius. Gooi vervolgens het bovenstaande weg met een pipet van één milliliter. Piket nu de celsuspensie 20 keer op en neer met 15 milliliter HBSS om deze te wassen en centrifugeer gedurende 300 minuten bij 10 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, suspendeert u de celpellet opnieuw in een milliliter magnetisch geactiveerde celsorteerbuffer. Breng om te beginnen een milliliter van de voorbereide eencellige suspensie over in een microcentrifugebuis van twee milliliter en centrifugeer gedurende drie minuten bij 300 G bij vier graden Celsius. Zodra het bovenstaande is verwijderd, suspendeert u de eencellige pellet opnieuw in 90 microliter magnetisch geactiveerde celsortering of maximale buffer. Voeg 10 microliter CD11b- of c-microbeads toe en incubeer de suspensie gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius op een horizontale schudder. Voeg vervolgens een milliliter maximale buffer rechtstreeks toe aan de buis om de eencellige suspensie te wassen. Na het centrifugeren suspendeert u de celpellet opnieuw in een buffer van maximaal 500 microliter. Breng met behulp van een pipet van één milliliter de opnieuw gesuspendeerde celsuspensie over naar de sorteerkolom in het magnetische veld. Terwijl het in het magnetische veld blijft, wast u de kolom drie keer met maximaal 500 microliter buffer. Verwijder vervolgens de sorteerkolom uit het magnetische veld. Voeg een milliliter max buffer toe aan de kolom en duw deze langzaam door met de zuiger. Verzamel de doorstroom. Zaai nu de geselecteerde cellen in een plaat met 24 putjes met een dekglaasje bedekt met Poly-L-lysine. Voeg 200 microliter kweekmedium toe en incubeer gedurende 20 minuten in een incubator van 37 graden Celsius met 95% zuurstof, 5% kooldioxide en 60 tot 80% luchtvochtigheid. Neem om te beginnen de gekweekte microglia geïsoleerd uit hersenweefsel van muizen. Lokaliseer de sferische microglia onder een watermicroscoop met behulp van het 40x-objectief. Vul vervolgens de elektrode met intracellulaire oplossing en bevestig deze aan de versterkerkop van de elektrofysiologische opstelling. Oefen positieve druk uit. Schakel over naar het 4x objectief en zoek de elektrode. Laat vervolgens de elektrode in de badoplossing zakken. Zet de amplifier in voltage clamp modus om de membraantest in badmodus uit te voeren. Schakel daarna terug naar het 40x-objectief en plaats de elektrodepunt dichter bij de microglia. Oefen vervolgens een kleine negatieve druk uit om de cel vast te houden. Wanneer de weerstand 100 megaohm bereikt, schakelt u in de membraantest over van de bad- naar de patchmodus. Wanneer de weerstand 300 megaohm bereikt, laat u de negatieve druk los. Wanneer de weerstand de vorming van een giga-ohm-afdichting tussen de elektrode en het microgliale membraan aangeeft. Schakel over van patch- naar celmodus in de membraantest. Oefen vervolgens een kleine hoeveelheid zuigkracht uit en initieer een elektrische schok om het membraan te scheuren. Schakel daarna over naar de spanningsklemmodus, open het opnameprogramma en registreer kaliumstromen gedurende 200 milliseconden.