Onthulling van histon-proteovormen met behulp van 2D-TAU gelelektroforese

Onze inspanningen zijn momenteel gericht op het beter karakteriseren van de bestaande correlatie tussen epigenetische veranderingen en metabole herbedrading, met als uiteindelijk doel het identificeren van nieuwe epigenetische therapeutische doelen. Gezien de dynamische en omkeerbare aard van epigenetische modificatie, zijn er onlangs verschillende epi-geneesmiddelen ontwikkeld, die hebben geleid tot de verbetering van de behandeling van kanker en de vermindering van chemoresistentie. Onlangs is er aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van voorbeeldkarakteriseringen, dankzij de toepassing van moderne massaspectometrie, gekoppeld aan de scheidingstechnieken, zoals top-page of high-performance vloeistofchromatografie.

De belangrijkste uitdaging bij de karakterisering van histon is het bestaan van ontelbare histon-proteovormen, die het resultaat zijn van de overspraak tussen dynamisch gemodificeerd enzym en de beschikbaarheid van metabolieten. Begin met het voorbereiden van een mini TAU-gel voor een mini verticaal polyacrylamidegel, elektroforesesysteem. Los hiervoor zes molaire ureum op in een oplossing van 15% acrylamide bis-acrylamide en een milliliter ultrapuur water onder zacht roeren bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens de andere componenten toe en pas het volume aan. Vul de vooraf ingestelde gelplaten met deze oplossing, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan en laat 1,5 centimeter over vanaf de bovenkant. Voeg er een milliliter isopropanol aan toe om de gel waterpas te maken.

Om de stapelgel voor te bereiden, lost u ureum op in een 6% acrylamide, bis-acrylamide met een milliliter ultrapuur water. Nadat u de andere componenten hebt toegevoegd, vult u de gelplaten met deze oplossing en plaatst u een kam met 10 putjes tussen de platen totdat de oplossing halverwege de tanden van de kam reikt. Los vervolgens zes molaire ureum, 5% ijsazijn en dubbel gedestilleerd water op om 100 microliter TAU-monsterbuffer te bereiden.

Los vervolgens het gevriesdroogde histonmonster op in 30 microliter TAU-monsterbuffer. Vul de minicassette met TAU loopbuffer met een eindconcentratie van 5% azijnzuur. Gebruik een spuit om de putjes van de gel met loopbuffer te spoelen en vul het monster met een micropipet in de putjes.

Sluit vervolgens de elektroforesekamer aan op de voeding en plaats de positieve elektrode op de bodem. Schakel af en toe de stroomtoevoer uit en spoel de gelwellen af met een spuit om luchtbellen van de onderkant van de gel te verwijderen. Nadat u de gel van de gelplaten hebt verwijderd, snijdt u de baan van interesse af met een schoon scalpel.

Was nu de gelbaan met 15 milliliter 0,5 M tris-hydrochloride, pH 8,8 gedurende 15 minuten. Bereid 15 milliliter evenwichtsbuffer één en twee voor met behulp van de hier getoonde componenten. Bewaar vervolgens evenwichtsbuffer twee in het donker.

Incubeer nu de gelbaan in 10 milliliter evenwichtsbuffer, één met zacht roeren gedurende 15 minuten en decanteer vervolgens. Incubeer daarna de gelbaan in 10 milliliter evenwichtsbuffer twee onder zacht roeren gedurende 15 minuten in het donker voordat u deze decanteert. Bereid vervolgens een 15% acrylamide-oplossende gel voor met behulp van de hier getoonde samenstelling.

Zet de gelplaat op en vul deze met de oplossende geloplossing, laat 1,5 centimeter over vanaf het einde van de lange gelplaat. Voeg er een milliliter isopropanol aan toe om de gel te egaliseren en laat deze polymeriseren. Zodra de gel is gepolymeriseerd, decanteert u de isopropanol en droogt u de put af met behulp van drie mm cellulosechromatografiepapier.

Steek de gesneden gelbaan in de oplossende gelput, gebruik een pincet om luchtbellen te voorkomen en sluit vervolgens de gelbaan af op de oplossende gel, met behulp van agarose met een laag smeltpunt van 0,5% in tris-glycine en SDS-buffer, met vijf microliter 0,003% broomfenolblauw. Plaats de gelplaten in de cassette en vul ze met tris glycine en SDS buffer. Laat de gel op 120 volt draaien totdat de broomfenolblauwe kleurstof de bodem bereikt.

Verwijder na het hardlopen voorzichtig de gel van de platen en gooi het overtollige agarose weg. Voer om te beginnen mini 2D-gel tritonzuurureum of TAU-elektroforese uit op histonmonsters, gevolgd door zilverkleuring. Bereid vervolgens de hier getoonde reagentia voor.

Gebruik een schoon scalpel om interessante histonplekken uit de gekleurde gel te verwijderen en plaats elke plek in een verse siliconenbuis van 1,5 milliliter om kruisbesmetting met isovormen te voorkomen. Voeg 250 microliter 50 millimolair ammoniumbicarbonaat of 50% acetonnitro toe aan elke gelplek en incubeer onder zacht roeren in een thermomixer bij kamertemperatuur. Decanteer de oplossing en herhaal dit proces drie keer totdat de gelstukjes transparant lijken.

Om de gelvlekken te dehydrateren, voeg je 200 microliter acetonstikstof toe. Tijdens deze stap worden de gelstukjes ondoorzichtig wit. Decanteer het acetonnitril en laat de gelvlekken 10 minuten aan de lucht drogen.

De stukjes gel lijken droog in de tubes. Rehydrateer vervolgens de gelvlekken door 20 microliter trypsine-oplossing toe te voegen of voldoende volume om de gelstukjes te bedekken. Incubeer de buizen in een thermomixer bij 37 graden Celsius onder zacht roeren gedurende ten minste vier uur en maximaal 16 uur.

Breng het supernatant, dat de drieluikpeptiden bevat, over naar een verse buis. Voeg 50 microliter extractieoplossing toe aan de gelstukjes en sonificeer tweemaal in een ultrasoon waterbad gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het supernatant, dat de extra drieluikpeptiden bevat, over naar dezelfde verse buis.

Gebruik een vriesdroogapparaat om de gepoolde geëxtraheerde peptiden bij 30 graden Celsius te drogen. In de buis vormt zich een gevriesdroogde pellet. Voeg nu 15 microliter 0,1% trifluorazijnzuur toe aan elke buis en incubeer voorzichtig in een thermomixer bij 25 graden Celsius.

Breng het bovenstaande over naar een injectieflacon voor vloeistofchromatografietandem, massaspectrometrie-analyse.