Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Dit onderzoek richt zich op het begrijpen van de vasculaire dynamiek in de macro-omgeving van het beenmerg met behulp van intravitale microscopie, met als doel te onthullen hoe bloedvaten reageren op normale en pathologische hematopoëse. We gebruiken geavanceerde beeldvormingstechnologieën zoals fotomicroscopie, transgene diermodellen en analyseren een tracer om dynamische vasculaire veranderingen in levend weefsel in de loop van de tijd te visualiseren en te kwantificeren. De belangrijkste vooruitgang is een verfijning van ons protocol om het dierenwelzijn te verbeteren en af te stemmen op de drie V's. Onze longitudinale benadering minimaliseert de chirurgische stappen en vermindert het aantal dieren dat nodig is voor ons onderzoek aanzienlijk.

Ons protocol komt tegemoet aan de behoefte aan niet-toxische, langdurige intravitale beeldvorming door gebruik te maken van een twee-fotonenmicroscoop, die diepe weefselpenetratie en visualisatie met hoge resolutie van celgedrag en interactie mogelijk maakt. Het gebruik van het 3D-geprinte hoofdimplantaat maakt het heel gemakkelijk om het interessegebied te vinden tijdens longitudinale beeldvormingssessies zonder te proberen de hoogte, of hoek of de volgorde te veranderen. We gebruiken dit protocol momenteel om specifieke endotheliale subtypes en hun respons op de ontwikkeling van leukemie en medicamenteuze behandeling te traceren om hun bijdrage aan de pathogenese van de ziekte beter te begrijpen.

Start om te beginnen de segmentatiesoftware en importeer de micro-CT DICOM-bestanden om de schedel te isoleren. Voer segmentatie op basis van drempels uit om het botweefsel te scheiden van de omliggende structuren. Pas complexe of ruisrijke gebieden handmatig aan om de segmentatie te verfijnen.

Importeer in 3D Slicer de DICOM-bestanden en laad de gegevensset. Bekijk de CT-segmenten in de axiale, sagittale en coronale plakweergaven. Open de segmenteditor en klik op Toevoegen om een nieuwe segmentatie te maken en klik vervolgens nogmaals op Toevoegen om een nieuw segment voor drempelwaarden te maken.

Klik in het deelvenster van de segmenteditor op het drempeleffect. Pas de schuifregelaars voor de onderste en bovenste drempel aan of voer numerieke waarden in om het gesegmenteerde gebied rood te markeren. Als u de gesegmenteerde schedel als stl-bestand wilt exporteren, schakelt u over naar de segmentatiemodule.

Zorg ervoor dat het segment met drempelwaarde is geselecteerd. Stel in de sectie Modellen exporteren/importeren en labelmaps het exporttype in op modellen en de bestandsindeling op stl en klik vervolgens op exporteren om het bestand op te slaan. Voor het voorbereiden van het schedelmodel in CAD importeert u eerst het vereenvoudigde schedelmodel in stl-formaat in de CAD-software als een nieuw onderdeel of model.

Maak in het middenvlak een as die tangentieel is aan de calvaria en sla vervolgens het voorbereide schedelmodel op. Maak een schets in het calvariale vlak en ontwerp een peervormige spline van AP plus 6,5 tot min twee. Met een breedte van zes millimeter bij AP 0.0 zal dit de waarneembare oppervlaktecontour zijn.

Ontwerp de staart van het implantaat en zorg ervoor dat deze zich aanpast aan de schedelstructuur voor een goede fixatie, met respect voor het beschikbare volume. Maak ten slotte een beschermkap om het observatievenster te beschermen wanneer het niet in gebruik is. Plaats een verdoofde muis op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 graden Celsius en houd de ademhalingsfrequentie visueel in de gaten.

Scheer het hoofd van de muis met een elektrisch scheerapparaat. Breng vervolgens een druppel oogheelkundige gel aan op de ogen van de muis. Zorg ervoor dat al het haar is verwijderd om beeldvormingsartefacten te voorkomen en het risico op wondinfectie te verminderen.

Gebruik nu een steriele tang en schaar om een kleine incisie te maken in het centrale deel van de hoofdhuid om het centrale botlitteken bloot te leggen. Verwijder het bindweefsel tussen de schedel en de hoofdhuid. Meng voldoende tandcement in een petrischaaltje om een pasta te maken.

Breng het snel aan op de onderkant van het hoofdfixatie-implantaat. Zonder dat tandheelkundig cement het beeldvormingsgebied binnendringt, plaatst u de hoofdhouder op de blootgestelde schedel en laat u deze uitharden. Schakel de isofluraanstroom in de richting van het stereotactische masker van de microscoop.

Breng de muis nu snel naar de microscoop. Steek de tanden van de muis voorzichtig in het masker om een goede penetratie van isofluraan te garanderen door de neus met één hand op te tillen. Terwijl u de muis met één hand vasthoudt, schuift u met de andere hand voorzichtig de zwaluwstaart van het hoofdfixatie-implantaat in de fixatiehouder.

Zet hem vast met een halve draai aan de schroefknop. Breng vervolgens een rectale sonde in die vooraf is ingebed met een gel op waterbasis om de temperatuur van de muis te controleren. Vul de beeldvormingskamer van het hoofd met een grote hoeveelheid gel op waterbasis of PBS.

Laat het wateronderdompelingsobjectief zakken totdat het volledig is ondergedompeld voor optimale excitatie en signaaldetectie tijdens twee-foton-excitatie. Verplaats de x-, y-fase en de z-aandrijving om scherp te stellen op het centrale bot in het steigerlitteken. Identificeer het weefsel dat wordt gemarkeerd door het botoppervlak en de centrale ader.

Doe het licht in de kamer uit en sluit het kastje om de microscoopstandaard. Na het activeren van de niet-TOSCAN-detectoren. Stel PMT1 in om tweede SHG te detecteren op 423 tot 461 nanometer, hoge D2 voor GFP op 485 tot 548 nanometer en hoge D3 voor TD D'Amato op 551 tot 645 nanometer.

Laat de offset op nul staan. Stel nu de PMT SHG-versterking in op 850 volt en de hoge D-versterking op 100%Verhoog het infraroodlaservermogen totdat een beeld met een dynamisch bereik van 200 grijsniveaus zichtbaar is op het laagste van de drie kanalen. In de acquisitiesoftware wordt het lokalisatiegebied met beenmergzakken aangegeven, ingekapseld in de botoppervlakken.

Om verschillende interessegebieden of ROI's te identificeren, activeert u Loss Navigator en creëert u een overzicht met behulp van de spiraalmodus. Klik op het pictogram met één afbeelding om geselecteerde ROI-posities vast te leggen en hernoem elke positie in de takenlijst. Om een Z-stapelvolume te verkrijgen, selecteert u de Z-stapelmodus en definieert u de stapgrootte op drie micrometer.

Deselecteer de optie Dezelfde stapelgrootte voor alle regio's en druk vervolgens op begin om te beginnen en op Einde om te voltooien. Klik na het vastleggen op stapel opnieuw definiëren. Druk op start om het verzamelen van afbeeldingen te starten en sla de afbeeldingen op in de juiste map.

Om een dynamisch kenmerk te meten, zoals vasculaire permeabiliteit, wijzigt u de acquisitiemodus in XYZT om een time-lapse te verkrijgen. Stel in de T-module het tijdsinterval in op drie minuten en de duur op één uur. Injecteer nu 100 microliter 70 kilodalton Dextran TRITC intraveneus met een concentratie van vier milligram per milliliter en begin met de acquisitie.

Nadat u de muis hebt overgebracht naar een operatievlek op een verwarmingskussen van 37 graden Celsius, brengt u intrasite-gel aan op de schedel om deze gehydrateerd te houden. Sluit het beeldvormingsgebied van het hoofdimplantaat af met de specifieke afdekking en zet de afdekking voorzichtig vast met een schroef. Plaats de muis in de verwarmingsbox die is ingesteld op 37 graden Celsius en wacht tot hij wakker wordt.

Zodra de muis volledig hersteld is, vervoert u deze naar de dierenfaciliteit en huisvest u deze in een schone kooi met hydrogel en omgevingsverrijking. Plaats voor longitudinale acquisities een kleine druppel oogheelkundige gel op de ogen van een muis met een reeds geïnstalleerde hoofdhouder. Verkrijg het overzichtsbeeld zoals eerder gedemonstreerd.

Lijn indien nodig de vorige en nieuwe afbeeldingen opnieuw uit met behulp van de module Afbeelding laden en uitlijnen. Open de schermafbeelding om posities op hun oorspronkelijke plaats te markeren. Het CAD-model van een titanium hoofdfixatie-implantaat is ontworpen om zich aan te passen aan de anatomische structuur van de schedel, waardoor een stabiele bevestiging aan de microscooptafel voor beeldvorming op cellulair niveau wordt gegarandeerd.

Het implantaat werd met succes aan de schedel van de muis bevestigd en maakte een stabiele beeldvorming in de loop van de tijd mogelijk, terwijl de muis normale activiteiten kon voortzetten. Het calvariale beenmergvaatstelsel werd gevisualiseerd met behulp van een tegelscan, waarbij een complex netwerk van arteriolen, overgangscapillairen en sinusoïden werd onthuld. Kwantitatieve vaatanalyse toonde segmentatie van vasculaire structuren aan, waardoor de diameter, lengte en rechtheid van het vat en hun correlatie konden worden gemeten.

Longitudinale beeldvorming legde progressieve remodellering van het calvariale vaatstelsel vast tijdens de progressie van leukemie, waarbij de vasculaire dichtheid in de loop van de tijd werd waargenomen. De vasculaire permeabiliteit werd dynamisch beoordeeld, waarbij differentiële retentie van fluorescerende kleurstof in de loop van de tijd werd aangetoond, waarbij differentiële permeabiliteit van verschillende beenmergvaten werd aangetoond.