Multimodale studie van cardiovasculaire remodellering bij muizen: vierdimensionale echografie en massaspectrometriebeeldvorming

Ons laboratorium maakt gebruik van preklinische echografie om cardiovasculaire biomechanica te bestuderen bij verschillende ziekten en fysiologische toestanden. We gebruiken ook massaspectrometriebeeldvorming om de ruimtelijke verdeling van lipiden in cardiovasculair en hersenweefsel te bestuderen. We proberen te zien waar in weefsel we functionele en moleculaire veranderingen hebben.

Hoewel gangbare moleculaire beeldvormingstechnieken, zoals histologie en immunohistochemie, moleculaire gegevens kunnen opleveren, worden ze beperkt door de momenteel beschikbare kleuringen en antilichamen. Aan de andere kant is massaspectrometriebeeldvorming een ongerichte benadering voor multiomische studies die toch de ruimtelijke integriteit van het weefsel behoudt. Met onze techniek kunnen we multiomics uitbreiden met lipiden, glycanen en peptiden, en deze koppelen aan functionele beeldvormingstechnieken, zoals echografie.

Met deze technieken kunnen onderzoekers nu functionele beeldvorming koppelen aan moleculaire beeldvormingstechnieken. In ons lab hebben we twee belangrijke aandachtsgebieden voor hart- en vaatziekten, en een daarvan is kijken naar hartremodellering met hartaanvallen of kankerbehandelingen, dus cardiotoxiciteit. En ons tweede grote cardiovasculaire doel is kijken naar veroudering en hoe veroudering het vaatstelsel beïnvloedt.

Om vierdimensionale echografie van het hart uit te voeren, plaatst u de muis in rugligging op de beeldplaat. Plaats vervolgens de transducer in de houder in een semi-vergrendelde positie. Lijn de verhoogde stip op de transducer uit met de blauwe stip op het scherm en plaats deze naar de rechterkant van de muis.

Draai de transducer om langs het sagittale vlak van de muis uit te lijnen met de verhoogde inkeping caudaal gericht. Breng een ruime hoeveelheid ultrasone gel aan op het ventrale oppervlak van de borstholte voor akoestische koppeling met een transducer. Laat de transducer zakken totdat deze in contact komt met de ultrasone gel.

Maak nauwkeurige aanpassingen met de XY-knoppen aan de onderkant van de plaat voor fijnafstemming. Zorg er vervolgens voor dat de peristernale weergave van de lange as op het scherm de apex, het uitstroomkanaal van de linkerventrikel en de aorta omvat, horizontaal uitgelijnd voor nauwkeurige beeldvorming. Selecteer Naam Afbeelding in de benedenhoek van het scherm om de afbeelding op te slaan in de huidige serie.

Draai de transducer 90 graden met de klok mee om een peristernaal korte-asbeeld te verkrijgen. Zorg ervoor dat de linkerventrikel duidelijk is gedefinieerd in de afbeelding en dat de papillaire spieren zichtbaar zijn. Selecteer het kubuspictogram in de linkerbovenhoek van het scherm om een vierdimensionale afbeelding in te stellen.

Nadat u de transducer hebt gereset, stelt u de startpositie in op net onder de apex en de stoppositie op de aortaboog. Stel de stapgrootte in op 0,08 tot 0,13 millimeter en de framerate op 200 tot 300 hertz. Zorg ervoor dat vitale functies en het ECG-signaal stabiel blijven voordat u de scan start.

Nadat u de scan en verwerking hebt voltooid, schakelt u EKV/4D-gegevens opslaan en Respiration Gating in voor nabewerking. Selecteer Naam Afbeelding in de rechterbenedenhoek en neem de muis-ID op in de naam. Als u elk beeldvlak door de hartcyclus wilt visualiseren, selecteert u Meer bedieningselementen en kiest u Laden in vierdimensionaal.

Bekijk elk vlakbeeld van het hart en bevestig dat het midden van het hart stabiel blijft gedurende de hartcyclus. Bereid om te beginnen aluminiumfolieboten voor op het snel invriezen van muizenweefsels. Gebruik een tang om de huid van de geëuthanaseerde muis te tenten en snijd met een schaar door de tenthuid over de nek voor vasculaire toegang of net onder het borstbeen voor cardiale toegang.

Ga door met het doorsnijden van de huid- en spierlagen om het vaatstelsel bloot te leggen. Snijd voor hartverwijdering door het bot om het hart bloot te leggen. Gebruik stompe dissectie met wattenstaafjes om het hart of vaatstelsel te isoleren van omliggende weefsels, inclusief vet.

Scheid voorzichtig de halsslagader van de zenuw. Verwijder vervolgens het hart of vaatstelsel met behulp van chirurgisch gereedschap. Plaats het halsslagadervat, het hart en het vaatstelsel op een vooraf gelabelde boot van aluminiumfolie.

Plaats de boten vervolgens in vloeibare stikstof voor flitsbevriezing. Vul om te beginnen een bekerglas met HPLC-water en zet het opzij samen met spuiten van vijf en een milliliter. Stel vervolgens de cryostaattemperatuur in op min 25 graden Celsius en plaats het mes.

Plaats een tang in de cryostaatkamer om af te koelen voordat u het weefsel monteert. Zuig vijf milliliter HPLC-water op in een spuit en plaats deze in de cryostaat om het water gedeeltelijk te bevriezen. Voordat het water in de spuit volledig bevriest, doseert u het op de metalen boorkop en laat u het volledig bevriezen.

Vul nu een spuit van één milliliter met HPLC-water en plaats deze in de cryostaat. Plaats na 30 tot 60 seconden een kleine klodder gedeeltelijk gestold water op het midden van de boorkop. Plaats met een tang snel het geëxtraheerde muizenhart in de waterdruppel en houd het daar vast totdat het omringende water volledig bevroren is.

Haal om te beginnen de dia met het gemonteerde muizenhart uit de vriezer en plaats deze in een exsiccator om te drogen. Zet de HTX M3+Sprayer aan. Open de HTX-app op de laptop en stel in de methode de temperatuur van het mondstuk in op 75 graden Celsius, het debiet op 100 microliter per minuut en de druk op 10 psi.

Noteer de monsternaam, polariteit, matrix, oplosmiddel en concentratie in het laboratoriumnotitieboekje. Bereken vervolgens de matrixhoeveelheid die nodig is voor de gewenste concentratie. Weeg vervolgens de gewenste hoeveelheid 2,5-dihydroxybenzoëzuur af voor de positieve modusmatrix.

Los de matrix op in 70% methanol in een buisje van 15 milliliter. Sonificeer de matrixoplossing gedurende 10 minuten. Verwijder tijdens de sonicatie het glaasje van de exsiccator

Open de spuitlade. Plaats vervolgens de dia in de linkerbenedenhoek en plak de randen vast. Selecteer het spraygebied van het monster en sluit de tray.

Zuig met behulp van een spuit en filter de matrixoplossing op in de spuit. Filtreer de matrixoplossing door de spuit in de injectieflacon met het zwarte deksel aan de linkerkant van de sproeier. Plaats de injectieflacon terug op de daarvoor bestemde plek op de sproeier en plaats de D-leidingslang stevig in de injectieflacon.

Schakel vervolgens het inerte gas in en controleer of de meter op de sproeier 10 psi aangeeft. Druk op Start en zodra de sproeier de ingestelde temperatuur heeft bereikt, selecteert u de knipperende Start-knop om te beginnen met spuiten. Nadat de spray is voltooid, verwijdert u het monster uit de sproeier en plaatst u het in de MALDI-objectglaasjeshouder.

Scan de MALDI-diahouder en -dia met een scanner. Sla de afbeelding op een flashstation op voor gebruik met massaspectrometrie. Selecteer de optie Wassen op de sproeier en verplaats de D-lijn van de matrixflacon naar de afvalbeker.

Spuit ten slotte methanol op de spuitbak en veeg deze schoon. Schakel de stikstof uit. MALDI-massaspectrometriebeeldvorming van infarctweefsel van myocardweefsel identificeerde moleculaire ionenmassa tot lading 577,52, waarschijnlijk overeenkomend met COHb in C of D, wat wijst op betrokkenheid bij myocardiale remodellering.

Het vierdimensionale echografiebeeld toonde myocardiale gebieden met een gespannen oppervlakte van minder dan 20%, gevisualiseerd als groengeel weefsel, wat aangeeft dat er infarcten zijn. In de lange-asweergave van het myocardinfarctweefsel was lipide-delokalisatie zichtbaar, wat de correlatie tussen weefselbiomechanica en moleculaire samenstelling compliceerde.