Stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes

In dit protocol stellen we een stapsgewijze zelfstudie voor voor het meten van de bloedplaatjesgeassocieerde weefselfactor door middel van volbloedcytometrie, het beoordelen van het eiwit in het intracellulaire compartiment, arrestatiecondities en op het celoppervlak, zowel in rusttoestand als bij activering Met een DP wordt een van de meest voorkomende bloedplaatjesagonistweefselfactor tot expressie gebracht door een subset van bloedplaatjes. Als weefselfactor-positieve bloedplaatjes worden gemeten in PRP-bloedplaatjesrijk plasma of in gewassen bloedplaatjes, kan deze subgroep verloren gaan tijdens de monstervoorbereiding. Dit risico doet zich niet voor wanneer deze evaluatie in een muur wordt uitgevoerd.

Bloedplaatgeassocieerde weefselfactor is controversieel sinds het eerste rapport dat aan het begin van de eeuw werd gepubliceerd vanwege pre-analytische en methodologische problemen. Dit protocol werpt licht op deze kwesties en wordt ook gebruikt om een internationaal project uit te voeren dat wordt ondersteund door de International Society of Thrombosis and hemostasis ISDH om bloedplaatjesgeassocieerde weefselfactormeting te standaardiseren of bloedstroomcytometrie wordt uitgevoerd op een paar microliter bloed, waardoor bloedplaatjesgeassocieerde weefselfactoranalyse mogelijk is die geschikt is in de klinische setting. Bovendien maakt de mogelijkheid om het monster te fixeren en achteraf te labelen, deze analyse haalbaar voor veel ziekenhuizen en laboratoria.

Bereid om te beginnen een reageerbuis voor elk antilichaamvolume. Om te testen voeg je een druppel negatieve kralen en een druppel positieve kralen toe aan elke reageerbuis. Voeg 20 microliter van elke antilichaamverdunning toe aan de reageerbuis en vortex.

Incubeer de reageerbuisjes onmiddellijk in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens een milliliter PBS zonder calcium en magnesium pH 7,4 toe aan elke buis en vortex, keer de natriumcitraatvacutainer vijf keer voorzichtig om om het bloed en het antistollingsmiddel grondig te mengen. Breng 50 microliter bloed over in een buisje van 1,5 milliliter.

Voeg vervolgens 950 microliter 1% paraform aldehyde toe. Meng het monster voorzichtig en incubeer het gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster nu vijf minuten bij 1.500 G met een pauze bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van het bovenstaande Reese, suspendeer de pellet in een milliliter PBS zonder calcium en magnesium. Bij een pH van 7,4 doseert u 100 microliter gefixeerd bloed in elk buisje en centrifugeert u ze gedurende vijf minuten bij 1.500 G. Met pauze bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de bovenstaande resus.

Suspendeer de pellet in 100 microliter 0,1% Triton PBS om de monsters te permeren en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Bereid om te beginnen één tube voor op de fluorescentie minus één controle en één tube voor weefselfactorkleuring. Voeg antilichamen toe aan 100 microliter gefixeerd en permanent bloed in elke buis.

Voeg 300 microliter PBS zonder calcium en magnesium met een pH van 7,4 toe aan elke tube en meng. Bewaar de gekleurde monsters vervolgens in het donker totdat flowcytometrieanalyse alfa CD 1 42 HTF één monoklonaal antilichaam verdunt en Alexa Fluer 6 33 geitenanti-muis immunoglobuline G in PBS zonder calcium en magnesium. Bereid vervolgens drie monsterbuisjes voor en doseer PBS zonder calcium en magnesium.

Doseer bij pH 7,4 7,5 microliter verdund alfa-CD 1 42 htf één monoklonaal antilichaam en voeg vijf microliter adenosinedifosfaat toe. Keer de citraatvacutainer vijf keer voorzichtig om om het bloed en het antistollingsmiddel grondig te mengen. Doseer vijf microliter volbloed in elk buisje.

Meng de monsters voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg voor monsterfixatie 300 microliter 1%PFA toe aan elke buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.500 G met pauze bij kamertemperatuur. Zodra het bovenstaande is verwijderd, suspendeert resus de pellet in 90 microliter PBS zonder calcium en magnesium.

Bij pH 7,4 doseert u door voorzichtig te pipetteren vijf microliter verdunde Alexa Fluer 6, 33 immunoglobuline G en vijf microliter alfa-CD 41 PE in elke buis. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 300 microliter PBS zonder calcium en magnesium bij pH 7,4 toe aan elke buis en meng.

Om te beginnen maakt u een voorwaarts spreidingsgebied en een zijspreidingsgebied puntplot op een logaritmische schaal die alle gebeurtenissen weergeeft, maakt u een CD 61 A en een zijspreidingsgebied puntplot op een logaritmische schaal die alle gebeurtenissen weergeeft. Om de bloedplaatjespopulatie te visualiseren, stelt u de drempel in op ongeveer 2000 op de verstrooiingshoogte aan de zijkant en 1000 op de per CP B zes 90 H. Pas de PE Y 5 8 5 en per CP B zes 90 versterking aan volgens de dagelijkse kwaliteitscontrole en stel het debiet in op laag. Teken nu een gebied tussen 10 stralen tot de macht drie en 10 stralen tot de macht vijf, CD 61 positief genaamd.

Om de bloedplaatjespopulatie te identificeren, dupliceert u vervolgens de FMO en hernoemt u deze TFIC. Verkrijg de monsters en registreer een gegevensbestand van 10.000 gebeurtenissen binnen de CD 61 positieve poort. Maak een voorwaarts spreidingsgebied en een zijwaarts spreidingsgebied op een logaritmische schaal die alle gebeurtenissen weergeeft.

Maak een CD 41 A en een puntplot in het spreidingsgebied aan de zijkant op een logaritmische schaal waarop alle gebeurtenissen worden weergegeven. Pas vervolgens de Alexa-verdieping 6 33 versterking en de PE wifi 5 8 5 versterking aan volgens de dagelijkse kwaliteitscontrole. Stel de drempel ongeveer in op 1000 op de zijverstrooiingshoogte en op 2.500 op PEY 5 85 H.To visualiseer de bloedplaatjespopulatie, stel het debiet in op laag.

Teken nu een gebied tussen 10 stralen tot de macht vier en 10, verheven tot de macht vijf, CD 41-positief genaamd, om de bloedplaatjespopulatie te identificeren. Maak vervolgens een tube voor elk monster en noem TF Unstimulated en TF Stimulated. Verkrijg de monsters en registreer een gegevensbestand van 10.000 gebeurtenissen in de CD 41-positieve gangcentrifuge.

De 0,129 molaire natriumcitraat vacutainer bij 100 G gedurende 10 minuten zonder pauze bij kamertemperatuur. Haal vervolgens de vacutainer uit de centrifuge. Verzamel het verkregen bloedplaatjesrijke plasma, breng het over in een polypropyleen buisje van 10 milliliter en noteer het verzamelde aantal bloedplaatjes tweemaal in het bloedplaatjesrijke plasma met behulp van een bloedcelteller.

De bloedplaatjespopulatie geïdentificeerd door alfa-CD 61-antilichaamkleuring toonde aan dat ongeveer 26,8% van de circulerende bloedplaatjes intracellulaire weefselfactorflowcytometrieanalyse bevatte, wat aangaf dat de weefselfactor tot expressie komt door ongeveer 2,8% van de rustende bloedplaatjes en toeneemt tot 24,5% na activering met adenosinedifosfaat. Grotere bloedplaatjes bleken hogere weefselfactorniveaus tot expressie te brengen, waarbij de groene stippen de grotere subgroep van bloedplaatjes vertegenwoordigen. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat bloedplaatjesrijk plasma, bereid met behulp van centrifugatie van 100 g, een populatie behield die vergelijkbaar was met volbloed, met behoud van grotere bloedplaatjes met een hogere positiviteit van de weefselfactor.

Een hogere centrifugatiekracht leidde tot een verlies van positieve bloedplaatjes met een grotere weefselfactor, zoals blijkt uit de verminderde voorwaartse verstrooiing in de PRP-populatie.