Name: Stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Leer stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes voor tromboseonderzoek. Deze methode kwantificeert betrouwbaar TF-positieve plaatjes in rust en bij activatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Ricerca Corrente 2023 aan M.C.).

Het protocol werd goedgekeurd door het Ethische Comité van de Instelling (nr.70/24, CE 18.06.24) en er werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle bloeddonoren. Het protocol begeleidt de gebruiker door zeven hoofdstappen (Figuur 1). De eerste stap behandelt de procedure voor het uitvoeren van bloedafname. Stappen 2 en 3 beschrijven het protocol voor antilichaam titratie en monstervoorbereiding voor de analyse van intracellulaire TF-expressie met behulp van een fycoerytrine (PE)-gelabeld αCD142/HTF1 monoklonaal antilichaam (mAb). Stap 4 beschrijft het protocol voor het evalueren van het eiwit dat blootgesteld is aan het bloedplaatjesontwerp met behulp van een indirecte kleuringsmethode met αCD142/HTF1 mAb. Vanwege de sterische hindering van de fluorochroom bindt het PE-gelabelde mAb dat voor intracellulaire kleuring wordt gebruikt niet aan het katalytische domein van het blootgestelde eiwit op het oppervlak. Daarom wordt een protocol voor indirecte kleuring met een Alexa Fluor 633-gelabeld secundair mAb voorgesteld. Stappen 5 en 6 beschrijven de fasen van flowcytometrieanalyse. De laatste stap beschrijft de procedure voor het bereiden van bloedplaatjesrijk plasma (PRP) om het verlies van de grote grootte bloedplaatjessubpopulatie te voorkomen. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel van materialen.
1. Bloedafname
OPMERKING: Het verzamelen van menselijk bloed mag alleen worden uitgevoerd na goedkeuring van het Ethische Comité.
<ol>
	<li>Verzamel bloedmonsters door veneuze of naaldacanule-afname van een arm die niet is aangetast door perifere veneuze infusies, bij voorkeur van de vena antecubitalis.
	<ol>
		<li>Voor veneuze afname, breng de tourniquet aan en verwijder deze na het inbrengen van een G19 vlindernaald in de ader om bloedplaatjesactivering te voorkomen (Figuur 2). 
		OPMERKING: Gebruik geen vlindernaald kleiner dan G21 om bloedplaatjesactivering te voorkomen.</li>
		<li>Voor veneuze afname met een naaldacanule, breng de tourniquet op geen enkel moment tijdens het afnemen aan. Indien nodig, spoel het monster met 0,9% zoutoplossing voordat u het neemt. Gooi altijd de eerste 5 ml bloed weg voordat u begint met het vullen van buisjes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zuig 2 ml bloed op in een EDTA-vacutainer (voor gebruik bij bloedceltelling). Meng de buis voorzichtig drie keer om volledige menging van bloed en anticoagulans te garanderen.</li>
	<li>Zuig bloed op in een vacutainer met 0,129 M natriumcitraat voor de analyse van trombine-geassocieerde TF-expressie. Vul de vacutainer zorgvuldig tot het aangegeven niveau om de juiste bloed/anticoagulansverhouding te behouden. Draai de buisjes vijf keer om om een grondige menging van het bloed met het anticoagulans te garanderen, waardoor vorming van stolsels en hemolyse van de monsters wordt voorkomen. 
		OPMERKING: Het gebruik van 0,129 M citraat-anticoagulans wordt aanbevolen om de detectie van trombine-geassocieerde TF met de HTF1-klonering van de αCD142 mAb te optimaliseren. Als het noodzakelijk is om bloedplaatjes uit volbloed te isoleren, zuig een tweede vacutainer met 0,129 M natriumcitraat op voor bereiding van bloedplaatjesrijk plasma (PRP).</li>
	<li>Houd de vacutainers rechtop in een buisjeshouder. Schud ze niet op roterende of kantende platen en vermijd pneumatisch transport. Koel de bloedmonsters niet om bloedplaatjesactivering te voorkomen. 
		OPMERKING: Bloedmonsters moeten bij voorkeur binnen 15 minuten na afname worden verwerkt als er een ander granulaat-geassocieerd bloedplaatjesactivatiemarker moet worden gemeten samen met TF. Anders moeten monsters niet later dan 3 uur na afname worden verwerkt (Figuur 3).</li>
</ol>
2. Titratie van het anti-TF-antilichaam (voor intracellulaire TF-evaluatie)
OPMERKING: De bepaling van intracellulair opgeslagen TF wordt uitgevoerd met behulp van de PE-αCD142/HTF1 mAb.
<ol>
	<li>Antilichaamtitratie met behulp van kralen 
		OPMERKING: Het gebruik van kralen maakt het mogelijk om de juiste hoeveelheid antilichaam te definiëren (d.w.z. de antilichaamconcentratie die de grootste scheiding van fluorescentiepieken tussen positieve en negatieve monsters produceert). Deze analyse wordt uitgevoerd met behulp van twee monsters, één echt positief en één echt negatief. De antilichaamconcentratie wordt niet gerapporteerd door de fabrikant (zie Tabel van materialen), dus wordt antilichaamtitratie uitgevoerd met behulp van vijf verdunningspunten.
	<ol>
		<li>Centrifugeer het antilichaam gedurende 5 min bij 17.000 x g bij 4 °C. Om de vijf antilichaamdverdunningspunten voor te bereiden, pipet 40 μL antilichaam in buis 1 en 20 μL PBS in buizen 2 tot en met 5. Maak vier opeenvolgende seriële 1:2-verdunningspunten door 20 μL van buis 1 naar buis 2 over te brengen en vervolgens verder te gaan.</li>
		<li>Bereid één testbuis voor elk te testen antilichaammogelijk. Voeg één druppel negatieve kralen en één druppel positieve kralen toe aan elke testbuis. Voeg 20 μL van elke antilichaamdverdunning toe aan de testbuis en vortex onmiddellijk. Incubeer in het donker op kamertemperatuur gedurende 20 min.</li>
		<li>Voeg 1 mL 1x PBS zonder Ca++ en Mg++, pH 7,4, toe aan elke buis en vortex.</li>
		<li>Verzamel de monsters op de flowcytometer volgens de instructies van de fabrikant en registreer een gegevensbestand van 10.000 gebeurtenissen in de "kralen"-poort. De optimale antilichaamconcentratie is degene die de grootste scheiding tussen positieve en negatieve pieken biedt.</li>

Assessing Intracellular and Surface TF-Positive Platelets via Flow Cytometry

<ol><li>Camera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+induces+cell-surface+immunoreactive+tissue+factor+expression%2C+which+is+modulated+differently+by+antiplatelet+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet activation induces cell-surface immunoreactive tissue factor expression, which is modulated differently by antiplatelet drugs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1690-1696 (2003).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+methodological+differences+account+for+the+current+controversy+on+tissue+factor+expression+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Do methodological differences account for the current controversy on tissue factor expression in platelets.</a> Platelets. 29 (4), 406-414 (2018).</li>
<li>Zillmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-associated+tissue+factor+contributes+to+the+collagen-triggered+activation+of+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Platelet-associated tissue factor contributes to the collagen-triggered activation of blood coagulation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 281 (2), 603-609 (2001).</li>
<li>Camera, M., Brambilla, M., Toschi, V., Tremoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+expression+on+platelets+is+a+dynamic+event%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue factor expression on platelets is a dynamic event.</a> Blood. 116 (23), 5076-5077 (2010).</li>
<li>Panes, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelets+synthesize+and+express+functional+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human platelets synthesize and express functional tissue factor.</a> Blood. 109 (12), 5242-5250 (2007).</li>
<li>Camera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response%3A+functionally+active+platelets+do+express+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Response: functionally active platelets do express tissue factor.</a> Blood. 119 (18), 4339-4341 (2012).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+in+patients+with+acute+coronary+syndromes%3A+Expression+in+platelets%2C+leukocytes%2C+and+platelet-leukocyte+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue factor in patients with acute coronary syndromes: Expression in platelets, leukocytes, and platelet-leukocyte aggregates.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (5), 947-953 (2008).</li>
<li>Canzano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+and+endothelial+activation+as+potential+mechanisms+behind+the+thrombotic+complications+of+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Basic+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Platelet and endothelial activation as potential mechanisms behind the thrombotic complications of COVID-19 patients.</a> JACC Basic Transl Sci. 6 (3), 202-218 (2021).</li>
<li>Trabattoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migraine+in+patients+undergoing+PFO+closure%3A+Characterization+of+a+platelet-associated+pathophysiological+mechanism%3A+The+LEARNER+study%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Basic+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Migraine in patients undergoing PFO closure: Characterization of a platelet-associated pathophysiological mechanism: The LEARNER study.</a> JACC Basic Transl Sci. 7 (6), 525-540 (2022).</li>
<li>Falanga, A., Schieppati, F., Russo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+tissue+procoagulant+mechanisms+and+the+hypercoagulable+state+of+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Cancer tissue procoagulant mechanisms and the hypercoagulable state of patients with cancer.</a> Semin Thromb Hemost. 41 (7), 756-764 (2015).</li>
<li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+coagulopathy%3A+An+update+on+pathophysiology%2C+biomarkers%2C+and+current+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced coagulopathy: An update on pathophysiology, biomarkers, and current guidelines.</a> Life (Basel). 13 (2), 350(2023).</li>
<li>Osterud, B., Olsen, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelets+do+not+express+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Human platelets do not express tissue factor.</a> Thromb Res. 132 (1), 112-115 (2013).</li>
<li>Bouchard, B. A., Krudysz-Amblo, J., Butenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+tissue+factor+is+not+expressed+transiently+after+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet tissue factor is not expressed transiently after platelet activation.</a> Blood. 119 (18), 4338-4339 (2012).</li>
<li>Basavaraj, M. G., Olsen, J. O., Osterud, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+tissue+factor+antibody+clones+on+detection+of+tissue+factor+in+blood+cells+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Differential ability of tissue factor antibody clones on detection of tissue factor in blood cells and microparticles.</a> Thromb Res. 130 (3), 538-546 (2012).</li>
<li>Maecker, H. T., Frey, T., Nomura, L. E., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry A. 62 (2), 169-173 (2004).</li>
<li>Butenas, S., Bouchard, B. A., Brummel-Ziedins, K. E., Parhami-Seren, B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity in whole blood.</a> Blood. 105 (7), 2764-2770 (2005).</li>
<li>Camera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+and+atherosclerosis%3A+Not+only+vessel+wall-derived+TF%2C+but+also+platelet-associated+TF%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue factor and atherosclerosis: Not only vessel wall-derived TF, but also platelet-associated TF.</a> Thromb Res. 129 (3), 279-284 (2012).</li>
<li>Siddiqui, F. A., Desai, H., Amirkhosravi, A., Amaya, M., Francis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+and+release+of+tissue+factor+from+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The presence and release of tissue factor from human platelets.</a> Platelets. 13 (4), 247-253 (2002).</li>
<li>Munnix, I. C., Cosemans, J. M., Auger, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+response+heterogeneity+in+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet response heterogeneity in thrombus formation.</a> Thromb Haemost. 102 (6), 1149-1156 (2009).</li>
<li>Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-based+coagulation%3A+Different+populations%2C+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet-based coagulation: Different populations, different functions.</a> J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+megakaryocytes+confer+tissue+factor+to+a+subset+of+shed+platelets+to+stimulate+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Human megakaryocytes confer tissue factor to a subset of shed platelets to stimulate thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 114 (3), 579-592 (2015).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+expression+on+platelet+surface+during+preparation+and+storage+of+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med+Hemother%22%5BJournal%5D)">Tissue factor expression on platelet surface during preparation and storage of platelet concentrates.</a> Transfus Med Hemother. 40 (2), 126-132 (2013).</li>
<li>Rao, L. V., Kothari, H., Pendurthi, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+encryption+and+decryption%3A+facts+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue factor encryption and decryption: facts and controversies.</a> Thromb Res. 129 (Suppl 2), S13-S17 (2012).</li>
<li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-labeled+antibodies%3A+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+platelet+tissue+factor+expression%3A+Regulation+by+P2Y%2812%29+and+Link+to+residual+platelet+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell surface platelet tissue factor expression: Regulation by P2Y(12) and Link to residual platelet reactivity.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (10), 2042-2057 (2023).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dit manuscript rapporteert gedetailleerde protocollen voor de evaluatie van TF-positieve bloedplaatjes door middel van flowcytometrie van vol bloed, waarbij rekening wordt gehouden met de analyse van het eiwit dat zowel binnen als op het oppervlak van de bloedplaatjes wordt aangemaakt.
Gedurende de afgelopen 20 jaar is de aanwezigheid van TF in menselijke bloedplaatjes goed vastgesteld1,2,3,4,5,17,18. Een subset van bloedplaatjes, die 20%-30% uitmaakt van de totale circulerende bloedplaatjespopulatie2, drukt het eiwit uit, wat het concept van de heterogeniteit van bloedplaatjes versterkt die steeds relevanter wordt in het veld19,20. Het is vermeldenswaard dat de TF-positieve bloedplaatjes een hoge gemiddelde bloedplaatjesvolume hebben, zoals eerder aangetoond door zeer gevoelige beeldvormende flowcytometrie2. Het is van cruciaal belang om deze eigenschap in overweging te nemen, vooral wanneer TF-expressie moet worden geanalyseerd in bloedplaatjes geïsoleerd van de andere bloedcelcomponenten. Het is inderdaad mogelijk dat de centrifugatiestap die wordt gebruikt voor de isolatie van bloedplaatjes, resulteert in het verlies van grote bloedplaatjes2. Dit pre-analytische probleem is waarschijnlijk een van de belangrijkste drijfveren van de controverse - die tot enkele jaren geleden duurde - over de aanwezigheid van TF in bloedplaatjes7,12,13. Flowcytometrie van vol bloed is in dit opzicht een uiterst nuttige benadering, waardoor de analyse van alle bloedplaatjessubsets mogelijk is zonder de noodzaak om ze te isoleren.
Een tweede reden die de discussie over de aanwezigheid van TF in bloedplaatjes heeft bevorderd, was de keuze van het anti-menselijke TF-antilichaam dat voor de analyse werd gebruikt. Er zijn veel commercieel verkrijgbare antilichamen die zijn gebruikt voor de evaluatie van bloedplaatjes-geassocieerd TF en die verschillende epitopen van het eiwit herkennen. Sommige antilichamen, zoals de TF9-10H10 3,21,22 en de VIC71,3 klonen, binden aan een niet-functioneel gebied van TF zonder de binding van FVII/FVIIa te beïnvloeden. Andere antilichamen, waaronder de VD81,2,3 en de HTF118 klonen - de laatste gebruikt in de huidige protocollen - herkennen de katalytische plaats van het eiwit, concurreren met FVII/FVIIa voor binding aan TF, en blokkeren zo de procoagulante functie. Het is belangrijk op te merken dat, afhankelijk van de glycosyleringstoestand van het extracellulaire domein en de conformatie van de katalytische plaats van TF23, die in bepaalde omstandigheden kan worden gemodificeerd (zoals celactivering of ziekte), sommige van deze antilichamen differentieel in staat kunnen zijn om door middel van flowcytometrie de oppervlakte-expressie van bloedplaatjes-geassocieerd TF te herkennen. Bovendien kunnen ook de kleurvoorwaarden, dwz of het te analyseren monster vers is, gefixeerd en/of gepermeabiliseerd, de epitopenconformatie en dus de antigeen-antilichaambinding14 beïnvloeden.
Een verdere overweging die aandacht verdient, is de keuze van het fluorochroom gebonden aan het antilichaam. Aangezien TF door slechts 20%-30% van de bloedplaatjespopulatie wordt aangemaakt, kunnen fluorochromen met lage emissie, samen met het gebruik van flowcytometers met lage gevoeligheid, niet geschikt zijn om lage positieve signalen te onderscheiden. Om deze reden zijn antilichamen gelabeld met heldere fluorochromen, zoals PE of APC, te verkiezen. Het is echter belangrijk op te merken dat de grote omvang van een fluorochroom zoals PE de binding van het gelabelde antilichaam aan het eiwit kan belemmeren24. Om dit probleem te overwinnen, werd in het huidige protocol de oppervlakte-TF-kleuring uitgevoerd als een indirecte markering met een ongeconjugeerd αCD142/HTF1 mAb, vervolgens onthuld door gebruik van een secundair antilichaam. De PE-sterische belemmering heeft geen invloed op de binding van αCD142/HTF1 mAb aan TF die intracellulair wordt opgeslagen, waar de katalytische plaats toegankelijker is voor antilichaambinding. Het is duidelijk dat de beoordeling van de oppervlakte-expressie van bloedplaatjes-geassocieerd TF door directe markering, vergeleken met de indirecte, bij voorkeur - indien mogelijk - zou zijn om de bemonsteringstijd te verkorten. Deze benadering moet echter rekening houden met de kritische kwesties die hierboven worden genoemd en die betrekking hebben op de bindingscapaciteit van de verschillende commercieel verkrijgbare antilichamen voor bloedplaatjes-TF, vanwege de conformatie van het eiwit zelf, of de kleurvoorwaarden, evenals de sterische belemmering van de verschillende fluorochromen die worden gebruikt. Daarom om valse negatieve resultaten te voorkomen, vereist directe markering van oppervlakte-geëxpremeerd bloedplaatjes-geassocieerd TF een verplichte zorgvuldige optimalisatieproces. Deze aspecten zijn het onderwerp van een lopend onderzoek gericht op het evalueren van de efficiëntie van directe kleuring met de verschillende commercieel verkrijgbare antilichaamklonen gelabeld met alle in gebruik zijnde fluorochromen.
Verschillende studies hebben aangetoond dat de expressie van TF verhoogd is in verschillende pathologische aandoeningen gekenmerkt door

<a href="https://app.jove.com/t/6667">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/67356-v">10.3791/67356-v</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/67356">Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets

Weefselfactor (TF), een transmembraan glycoproteïne en belangrijke activator van de bloedstollingscascade, wordt tot expressie gebracht door een subset, ongeveer 20%-30%, van circulerende menselijke bloedplaatjes1, met name die met een grotere grootte2. Bij activering door klassieke bloedplaatjesagonisten zoals adenosinedifosfaat (ADP) en trombine, tonen bloedplaatjes functioneel actieve TF op hun oppervlak op een concentratie-afhankelijke manier, waardoor het kan binden aan factor VII/VIIa, wat uiteindelijk leidt tot trombinegeneratie1,3,4,5,6. Opmerkelijk is dat in pathologische aandoeningen zoals coronaire hartziekte (CHD)7, ernstige acute respiratoire syndroom-coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infectie8, migraine met aura geassocieerd met een open foramen ovale (MHA-PFO)9, kanker10 en sepsis11, het aantal TF-positieve bloedplaatjes significant toeneemt, wat bijdraagt aan het grotere trombotisch risico dat in deze klinische omgevingen wordt waargenomen.
Ondanks dit overtuigende bewijs, blijft de detectie van TF-positieve bloedplaatjes een onderwerp van debat binnen de wetenschappelijke gemeenschap6,12,13. Methodologische uitdagingen, waaronder pre-analytische variabelen, monstervoorbereiding en antilichaamspecificiteit, zijn gesuggereerd als mogelijke redenen voor de tegenstrijdige resultaten die in de literatuur worden gerapporteerd2,4,12,14. Daarom is het van cruciaal belang om een gestandaardiseerd assay op te stellen op basis van een goed gedefinieerd protocol voor het meten van TF in menselijke bloedplaatjes.
In deze context is doorstromcytometrie van vol bloed de enige technologie die de analyse van TF-positieve bloedplaatjes mogelijk maakt met minimale monsterverwerking, wat cruciaal is om het verlies van deze subset van bloedplaatjes te voorkomen.
In dit artikel stellen we een protocol voor voor het meten van bloedplaatjes-geassocieerde TF met behulp van doorstromcytometrie van vol bloed, waarbij het eiwit (1) intracellulair in rusttoestand wordt beoordeeld en (2) op het celoppervlak in zowel rust- als geactiveerde toestand. Er worden ook instructies gegeven als de evaluatie van TF-positieve bloedplaatjes in bloedplaatjesrijk plasma (PRP) vereist is.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5&rsquo;-difosfaat (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2754</td><td>&nbsp;Trombogenagonist</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 geit &alpha;-muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>Secundaire antistof</td></tr><tr><td>Biotube 10 mL</td><td>Biosigma</td><td>BSP048</td><td>Voor PRP-collectie</td></tr><tr><td>Vlindernaald G19</td><td>PIC-oplossing</td><td>02044019030010</td><td>Voor bloedafname</td></tr><tr><td>CytExpert Software</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Flow cytometry data-analyse</td></tr><tr><td>Cytoflex S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Flowcytometer</td></tr><tr><td>Eppendorf buisjes 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>1,20,086</td><td>&nbsp;Bloedfixatie</td></tr><tr><td>ImageStreamX Mk II</td><td>Cytek Biosciences</td><td></td><td>Beeldvormende flowcytometer</td></tr><tr><td>Kaluza Software</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Flow cytometry data-analyse&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Antibioticos &ndash; Divisione Carlo Erba Reagenti</td><td>387507</td><td>Om bloed en bloedplaatjes te fixeren</td></tr><tr><td>PerCP-&alpha;CD45</td><td>BD</td><td>345809</td><td>Leukecytenpopulatiemarker</td></tr><tr><td>PerCP-&alpha;CD61</td><td>BD</td><td>347408</td><td>Bloedplaatjespopulatiemarker</td></tr><tr><td>PE-&alpha;CD142</td><td>BD</td><td>550312</td><td>Anti-menselijke weefselfactor antistof</td></tr><tr><td>PE-&alpha;CD41</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07781</td><td>Bloedplaatjespopulatiemarker</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (PBS) 1x zonder calcium en magnesium</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Voor antilichamen en monsterverdunning</td></tr><tr><td>Pipetpunten 10 &micro;L&nbsp;&nbsp;</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F161630</td><td>Om monsters voor te bereiden</td></tr><tr><td>Pipetpunten 1000 &micro;L</td><td>Gilson</td><td>F161670</td><td>Om monsters voor te bereiden</td></tr><tr><td>Pipetpunten 200 &micro;L</td><td>Gilson</td><td>F161930</td><td>Om monsters voor te bereiden</td></tr><tr><td>Rondbodembuisje 5 mL</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Voor flowcytometerverwerving</td></tr><tr><td>Natriumchloride 0,9 %</td><td>BD</td><td>306575</td><td>Om de naald-canule na bloedafname te wassen</td></tr><tr><td>Sysmex XN-450</td><td>Dasit</td><td></td><td>Bloedcelanalysator</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>9002-93-1</td><td>Om de membraan van bloedcellen te permeabiliseren</td></tr><tr><td>Vacutainer-citraat 0,129M-buisjes</td><td>BD</td><td>363079</td><td>Voor bloedafname</td></tr><tr><td>Vacutainer K2 EDTA-buisjes</td><td>BD</td><td>368857</td><td>Voor bloedafname</td></tr><tr><td>Vacutainer-adapter voor meerdere monsters</td><td>BD</td><td>367300</td><td>&nbsp;Voor bloedafname</td></tr><tr><td>Vacutainer-enkelvoudige houder</td><td>BD</td><td>364815</td><td>&nbsp;Voor bloedafname</td></tr><tr><td>Versacomp Antibody Capture beads-kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>B22804</td><td>Antilichaamtitratie</td></tr><tr><td>&alpha;CD142 (clone HTF-1)</td><td>Invitrogen</td><td>16-1429-82</td><td>Anti-menselijke weefselfactor antistof</td></tr></tbody></table>

stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes

Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets

Een subset van circulerende menselijke bloedplaatjes slaat Tissue Factor (TF) intracellulair op, de belangrijkste activator van de bloedstollingscascade en trombusvorming. Bij activering van bloedplaatjes wordt TF blootgesteld op het celmembraan, waar het bindt aan FVII, wat uiteindelijk leidt tot trombinegeneratie. Aangezien (1) de niveaus van TF-positieve bloedplaatjes toenemen in verschillende klinische situaties, wat bijdraagt aan het protrombotische fenotype van de patiënt, en (2) verschillende geneesmiddelen de TF-expressie geassocieerd met bloedplaatjes kunnen moduleren, is een gestandaardiseerde methode voor het beoordelen van TF-positieve bloedplaatjes waardevol, aangezien de evaluatie ervan in het verleden controversieel is geweest. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van het percentage TF-positieve bloedplaatjes met behulp van flowcytometrie in vol bloed en bloedplaatjerijk plasma (PRP)/gewassen bloedplaatjes. Dit protocol beoogt gedetailleerde instructies te geven voor het kwantificeren van het percentage TF-positieve bloedplaatjes door de bepaling van het eiwit (1) intracellulair in rusttoestand en (2) op het celoppervlak, zowel in rust als in geactiveerde toestand. De eerste sectie biedt essentiële informatie voor het correct uitvoeren van bloedafname om ervoor te zorgen dat pre-analytische procedures de resultaten niet beïnvloeden. Vervolgens richt het protocol zich op de bereiding van monsters en labelprocedures voor flowcytometrie-analyse. Gedetailleerde stappen voor celstimulatie, labelen, fixatie en permeabilisatie - indien nodig - worden beschreven. Ten slotte worden instructies voor flowcytometrie-instellingen beschreven om de bloedplaatjespopulatie correct te identificeren en TF-positieve gebeurtenissen te analyseren. Ten slotte omvat de methode de procedure voor het bereiden van PRP als TF-positieve bloedplaatjes moeten worden gemeten in geïsoleerde bloedplaatjes. Aangezien alleen een subset van bloedplaatjes TF bevat, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat deze bloedplaatjes niet verloren gaan tijdens de centrifugeringsstappen die nodig zijn om PRP te verkrijgen.

Een samenvatting van de expressieanalyse van trombine-geassocieerde TF wordt beschreven in het stroomdiagram dat te zien is in Figuur 1. De stappen omvatten: (1) Bloedafname: Neem bloed af uit de menselijke perifere ader, bij voorkeur uit de antecubitale ader, met behulp van een G19 vlindernaald of een naald-canule zonder tourniquet en met vacutainers die anticoagulantia bevatten. (2) Sampleverwerking: Verwerk de monsters volgens het type TF-evaluatie dat moet worden uitgevoerd. (3) Samplelabeling: Label de monsters met specifieke antilichamen. (4) Analyse door middel van flowcytometrie: Analyseer de monsters om oppervlakkige en intracellulaire TF te detecteren.
Tijdens het afnemen van bloed moet er bijzondere aandacht worden besteed om activering van bloedplaatjes te voorkomen. Daartoe worden twee voorzorgsmaatregelen in acht genomen: het verwijderen van de tourniquet kort nadat de naald in de ader is gestoken, en het weggegooien van het bloed in de eerste vacutainer die wordt afgenomen. Zonder het gebruik van de tourniquet heeft de populatie bloedplaatjes, weergegeven in een FSC-A/SSC-A stipplot, een typische vorm, zoals te zien is in Figuur 2A. Daarentegen, met het gebruik van de tourniquet, resulteren de fysieke eigenschappen van de populatie bloedplaatjes in een langwerpige vorm die lijkt op de morfologie die wordt waargenomen na stimulatie met een klassieke bloedplaatjes-agonist, zoals ADP (Figuur 2B,C).
Experimenten die zijn uitgevoerd om de stabiliteit van de expressie van trombine-geassocieerde TF in de loop van de tijd te beoordelen, toonden aan dat deze stabiel was gedurende 3 uur na de bloedafname (Figuur 3). Wanneer de meting van TF-expressie wordt gecombineerd met die van een marker van bloedplaatjesactivatie, zoals P-selectine, wordt geadviseerd om het bloedmonster zo snel mogelijk te verwerken om degranulatie van bloedplaatjes te voorkomen.
Voor de analyse van intracellulair opgeslagen TF wordt het gehele bloed gefixeerd in 1% PFA, gepermeabiliseerd met PBS-Triton, en vervolgens gekleurd met een PE-gelabeld antilichaam. De populatie bloedplaatjes wordt geïdentificeerd op een logaritmische FSC-A/SSC-A plot (Figuur 4 A,D) en door αCD61 mAb kleuring (Figuur 4 B,E). Resultaten van de analyse van intracellulaire TF bij gezonde proefpersonen (n = 377) gaven aan dat TF aanwezig is in 26,8% ± 4,8% van de circulerende bloedplaatjes (Figuur 4F).
Analyse door middel van flowcytometrie van de expressie van oppervlakte-geassocieerde TF is uitgevoerd in rusttoestand en na celstimulatie met ADP 10 µM. De populatie bloedplaatjes van het gehele bloed, gelabeld met αCD41 mAb, is geïdentificeerd op een logaritmische FSC-A/SSC-A plot (Figuur 5A,B). Resultaten toonden aan dat bij gezonde proefpersonen (n = 377), TF wordt geëxpresseerd door 2,8% ± 1,4% van de rustende bloedplaatjes (Figuur 5D-F) en toeneemt tot 24,5% ± 5,8% na activering (Figuur 5G-I). TF wordt geëxpresseerd door de subset bloedplaatjes met de grootste grootte (Figuur 5D,G, groene stippen). Bovendien benadrukt analyse door middel van flowcytometrie met beeldvorming dat het TF signaal alleen geassocieerd is met αCD61 positieve en niet met αCD45 positieve gebeurtenissen (Figuur 7).
Zoals eerder vermeld, wordt TF opgeslagen in een subset van bloedplaatjes die zich kenmerkt door de grootste grootte binnen de gehele populatie. Daarom is het belangrijk om deze fractie bloedplaatjes niet te verliezen tijdens de bereiding van PRP. Volgens de aanwijzingen in de methode-sectie (stap 7), is het mogelijk om een populatie bloedplaatjes binnen PRP te isoleren die representatief is voor die in het gehele bloed. Zoals te zien is in Figuur 6, is de flowcytometrie dot plot van de populatie bloedplaatjes verkregen door 100 x g centrifugatie van het gehele bloed zeer vergelijkbaar met die van het gehele bloed in termen van FSC-verdeling (Figuur 6 A,B). In tegenstelling, bij gebruik van een hogere kracht en langere centrifugatietijd, zoals vaak wordt gerapporteerd in de literatuur12,14,16, heeft de herstelde populatie bloedplaatjes een lagere FSC in vergelijking met die van het gehele bloed (Figuur 6C), wat wijst op het verlies van de grotere bloedplaatjes, die TF-positief zijn.
<img alt="Flow cytometry experimenteel procesdiagram voor TF-analyse in bloedmonsters; secties en stappen getoond." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig01.jpg" data-altupdatedat="1776139283000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Schematisch diagram voor expressieanalyse van trombine-geassocieerde TF en isolatie van bloedplaatjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.</a>
<img alt="Flow cytometry diagram van bloedcellen; WBC, RBC, en gegevens scatter plots voor analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig02.jpg

Dit artikel beschrijft het protocol voor het kwantificeren van het percentage Tissue Factor (TF)-positieve bloedplaatjes met behulp van flowcytometrie van vol bloed, waarbij het eiwit wordt beoordeeld: (1) intracellulair in rusttoestand, en (2) op het celoppervlak, zowel in rusttoestand als in geactiveerde toestand. Er wordt ook begeleiding gegeven voor het evalueren van TF-positieve bloedplaatjes in bloedplaatjesrijk plasma.

Stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes

A subset of circulating human platelets stores Tissue Factor (TF) intracellularly, the key activator of the blood coagulation cascade and thrombus ...

flow-cytometry-analysis-of-tissue-factor-expression-in-human-platelets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Hier beschrijven we een in-house extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest. Op activiteit gebaseerde assays en op antigeen gebaseerde assays zijn gebruikt om de weefselfactor te meten in extracellulaire blaasjes van menselijke plasmamonsters. Op activiteit gebaseerde assays hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit dan op antigeen gebaseerde assays.

Extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Meerkleurige flowcytometrie voor bloedplaatjes kan nieuwe subtypes van bloedplaatjes identificeren binnen klassieke subpopulaties van bloedplaatjes, zoals rust-, aggregatoire, procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes. Dit maakt het mogelijk om verschillende subpopulatiepatronen te vergelijken die worden geïnduceerd door verschillende bloedplaatjestagonisten. Hier wordt een procedure voor het opstellen van een meerkleurig flowcytometriepaneel in detail beschreven.

Analyse van subpopulaties van bloedplaatjes door middel van meerkleurige flowcytometrie

Het huidige protocol biedt een uitgebreide reeks procedures die nodig zijn om procoagulerende bloedplaatjes te analyseren, die overlappende kenmerken van necrose, apoptose en activering van bloedplaatjes vertonen.

Uitgebreide analyse van procoagulerende bloedplaatjes die kenmerken van necrose, apoptose en activering van bloedplaatjes vertonen

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Cilia-gegenereerde vloeistofstroom in Blaasjes Kupffer's (KV) regelt links-rechts patroonvorming van de zebravis embryo. We beschrijven een techniek voor het moduleren genfunctie specifiek in KV cellen. Verder tonen we hoe fluorescerende kralen leveren in KV om vloeistofstroming visualiseren.

Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer&#39;s

We beschrijven een techniek voor de analyse van globale RNA synthese in hypoxie met beeldvorming. Instructies-chemische kenmerken van RNA niet eerder is uitgevoerd onder hypoxie en maakt visualisatie van globale RNA veranderingen op enkele cel. Deze aanpak vormt een aanvulling op de bestaande gemiddelde RNA-technieken, waardoor directe visualisatie van cel-naar-cel veranderingen in de wereldwijde RNA synthese.

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Leer stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes voor tromboseonderzoek. Deze methode kwantificeert betrouwbaar TF-positieve plaatjes in rust en bij activatie.

Stroomcytometrie-analyse van weefselfactorexpressie in menselijke bloedplaatjes

Meer video's verkennen