Het meten van enzymatische activiteit van met neurologische ontwikkelingsstoornissen geassocieerde deubiquitylerende enzymen via een in vitro ubiquitineketensplitsingstest

We zijn geïnteresseerd in het definiëren van de moleculaire basis van neurologische ontwikkelingsstoornissen geassocieerd met genvarianten in enzymen van het ubiquitinesysteem. We gebruiken geavanceerde technieken om de signaalroutes die door die enzymen worden aangestuurd te ontleden en om de impact van genvarianten op de eiwitbiologie te bepalen. Het voordeel van deze methode is dat het een substraatonafhankelijke techniek is waarvoor geen voorkennis nodig is van de substraten die door een specifieke DUB worden gereguleerd.

Op deze manier kunnen we direct de impact van neurologische ontwikkelingsstoornis-geassocieerde genvariatie op de DUB-katalytische activiteit meten en mogelijke pathogene mechanismen suggereren. Omdat de cellulaire functies van de meeste DUB's slecht worden begrepen, zal ons laboratorium zich richten op het identificeren van de signaalroutes die deze enzymen bemiddelen en hoe genvarianten die verband houden met genetische ziekten deze processen beïnvloeden. Ontdooi om te beginnen 20 microliter chemisch competente Rosetta 2 Escherichia coli-cellen op ijs direct voor gebruik.

Voeg één tot 10 nanogram van het pGEX6P1 USP27X-expressieplasmide toe en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Hitteschok de cellen gedurende 30 seconden bij 42 graden Celsius in een droog bad. Incubeer de cellen vervolgens twee minuten op ijs.

Voeg 80 microliter SOC-medium op kamertemperatuur toe aan de cellen. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius met 200 RPM rotatie in een 19-millimeter orbit benchtop temperatuurgecontroleerde shaker. Plak vervolgens 50 microliter van de cultuur op een LB-agarplaat, aangevuld met chlooramfenicol en ampicilline.

Incubeer gedurende 20 uur bij 37 graden Celsius, met het deksel naar beneden, in een temperatuurgecontroleerde incubator. Kies een enkele kolonie getransformeerde bacteriën en voeg deze toe aan 10 milliliter steriel LB-medium aangevuld met chlooramfenicol en ampicilline. Incubeer gedurende 20 uur zoals eerder getoond.

Voeg vervolgens 10 milliliter van de nachtcultuur toe aan een liter TB-medium aangevuld met chlooramfenicol en ampicilline. Incubeer totdat de optische dichtheid op 600 nanometer 0,5 tot 0,6 bereikt. Voeg vervolgens 50-micromolair isopropyl bèta-d-1-thiogalactopyranoside toe aan de cultuur om expressie te induceren.

Nadat het monster is afgekoeld tot 16 graden Celsius, incubeert het gedurende 20 uur bij 16 graden Celsius met een rotatie van 200 RPM. Centrifugeer de cellen vervolgens 20 minuten bij 3000 G of hoger bij vier graden Celsius om de cellen uit de expressiecultuur te pelleteren. Bewaar de pellet tot slot minimaal een uur bij min 80 graden Celsius.

Zet om te beginnen de lege zwaartekrachtstroomkolom vast in een retortstandaard. Vul de kolom met twee tot drie milliliter gluthathione-agarosehars om een celpellet te zuiveren die is verzameld uit één liter expressiecultuur. Was de kolom met een harsbedvolume van 20%ethanol.

Ontdooi na het wassen van de kolom de celkorrel bij vier graden Celsius. Voeg 30 milliliter MS500-buffer toe aan de ontdooide pellet en incubeer met zachte end-over-end rotatie. Sonificeer nu de gelyseerde cellen in een centrifugebuis van 50 milliliter op ijs totdat het lysaat vrij stroomt wanneer het uit een pipetpunt wordt gedoseerd.

Centrifugeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en 20.000 G of hoger om het supernatant te verwijderen. Doe het supernatans vervolgens in een bekerglas en plaats het geklaarde lysaat op de kolom. Laat het lysaat door de kolom lopen door de zwaartekracht terwijl u de doorstroming opvangt.

Was daarna de kolom met ten minste twee harsbedvolumes MS500-wasbuffer en verzamel de wasstroom in fracties van vijf milliliter. Voeg vervolgens één microliter van elke fractie toe aan 100 microliter Bradford-reagens om te controleren op de aanwezigheid van eiwitten. Herstel het eiwit door de MS500-eliusiebuffer door de kolom te laten lopen en elutiefracties van vijf milliliter te verzamelen.

Om het eiwit neer te slaan, voegt u twee volumes ammoniumsulfaat van vier molairen toe aan het eluaat en keert u de buis voorzichtig om totdat deze troebel wordt. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en 20.000 G of hoger. Verwijder het supernatans na elke centrifugatie zonder de eiwitkorrel te verstoren.

Los vervolgens het eiwit weer op in MS500 buffer aangevuld met 25%glycerol voordat je het bewaart. Bereid 10 microliter gezuiverde GST-gelabelde USP27X in deubiquitylerende enzymactiveringsbuffer voor elk tijdstip voor elk deubiquitylerend enzym. Voordat u ubiquitineketens toevoegt, voegt u zeven microliter SDS-PAGE-laadbuffer toe aan het time zero-monster om te voorkomen dat de deubiquityleringsreactie begint.

Voeg aan elk tijdstip voor elk deubiquitylerend enzym 375 nanogram K63-gekoppelde di-ubiquitineketens toe, verdund in 10 microliter enzymactiveringsbuffer. Incubeer de buizen bij 30 graden Celsius en stop elk tijdstip door zeven microliter SDS-PAGE-laadbuffer toe te voegen. Voer SDS-PAGE uit met behulp van een gel met een gradiënt van vier tot 12%.

Wildtype USP27X splitste K63-gekoppelde di-ubiquitineketens na één uur incubatie tot mono-ubiquitine. De XLID-105 geassocieerde variantie F313V, Y381H en S404N splijten K63-gekoppelde di-ubiquitineketens niet na één uur incubatie.