Name: Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest voor kankeronderzoek met humane monocyt-afgeleide macrofagen in een 3D collageen I-matrix. Deze methode helpt bij het bestuderen van macrofaaggedrag en tumorcelinvasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Onderzoek naar macrofaag-tumor sferoïde interacties in een 3D-collageenmatrixopstelling

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 &micro;-Slide Angiogenesis&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen I Rat Tail&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio&amp;Cell</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Fiji&nbsp;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 Version: 2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%&nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>H1299-GFP cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>l-glutamine&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lymphocyte Seperation Medium (LSM) 1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>nonessential amino-acids&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 Well, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp;</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

We willen het samenspel van kanker en immuuncellen onderzoeken om beter te begrijpen hoe ze met elkaar interageren tijdens metastase. In de meeste gevallen zijn in vivo-modellen de gebruikelijke manier om onderzoeksvragen te onderzoeken met betrekking tot de 3D-invasie van kankercellen in de context van het immuunsysteem, of zijn geïsoleerde componenten van het systeem in de focus. Een methode die de analyse van cellulair gedrag toestaat die de complexiteit van de in vivo-situatie nabootst, maar die een meer directe manipulatie van specifieke omgevingskenmerken onder de microscoop mogelijk maakt.We demonstreren dat onveranderde kankercellen de invasie in de 3D-collageen I-matrix zullen verminderen wanneer ze samen worden gekweekt met macrofagen die zijn gedepleteerd voor het motorische eiwit KIF16B. Dit wijst op een rol van KIF16B-gestuurde recycling van oppervlakte-eiwitten van macrofagen in de tumoromgeving. We willen onze methode verder verbeteren op een manier die de visualisatie van matrixdegradatie op het grensvlak van macrofaagkankercelcontext mogelijk maakt, waardoor een beter begrip van degradatieve en adhesiemechanismen wordt verkregen.Begin met het kweken van H1299 GFP-cellen met een kankercelmedium in een celkweekflacon van 25 vierkante centimeter bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide tot ze 80% confluentie bereiken. Was de cellen eenmaal met DPBS en voeg een milliliter Trypsin-EDTA toe gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen loskomen. Stop de enzymatische reactie door twee milliliter kankercelmedium toe te voegen.Centrifugeer vervolgens de losgekomen celsuspensie in een 15-milliliterbuis bij 245 G gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant met trypsinoplossing en was vervolgens het pellet met vijf milliliter DPBS. Na centrifugatie, re-suspendeer het pellet in vijf milliliter kankercelmedium.Tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer. Breng 8.000 cellen over in een 96-well ultra lage adhesie plaat in een eindvolume van 25 microliter kankercelmedium. Incubeer de cellen gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Na drie dagen controleer je de sferoïden onder de microscoop op uniformiteit. Na het verzamelen van het menselijke bloedmonster, breng 20 milliliter bloed over van een transfusiezak in een 50-milliliter reactiebuis. Voeg 15 milliliter lymfocytscheidingsmedium toe aan een nieuwe 50-milliliterbuis.Breng voorzichtig 20 milliliter bloed over naar de buis met lymfocytscheidingsmedium zonder te mengen, en centrifugeer het mengsel bij 450 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Voeg tijdens het centrifugeren 10 milliliter koud RPMI 1640 Medium toe aan een nieuwe 50-milliliterbuis. Na centrifugatie, breng de dichte witte fase van de bloedhoudende buis over naar de voorbereide RPMI-houdende buis en vul deze op tot 50 milliliter met koud RPMI.Centrifugeer de suspensie bij 450 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en gooi het supernatant weg. Re-suspendeer het pellet in 10 milliliter koud RPMI en vul het op tot 50 milliliter met RPMI 1640. Centrifugeer de mix opnieuw, en re-suspendeer het pellet in 50 milliliter RPMI.Centrifugeer het monster opnieuw, en re-suspendeer het celpellet in 1,5 milliliter koud monocytbuffer. Voeg vervolgens 250 microliter anti CD14 MicroBeads toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. Tijdens de incubatie, bereid een scheidingskolom voor door een filter aan een magnetische scheider te bevestigen.Voeg 900 microliter monocytbuffer toe aan de kolom voor equilibratie. Na incubatie, giet de celsuspensie op de filter en laat deze door zwaartekracht in een afvalbuis stromen. Voeg een milliliter monocytbuffer toe om de kolom met de cellen gebonden aan magnetische parels te wassen.Vervang de afvalbuis onder de kolom door een verse 50-milliliterbuis met 20 milliliter RPMI. Voeg drie milliliter monocytbuffer toe aan de kolom. Verwijder de kolom van de magnetische rek en bevestig de stempel.Druk de cellen in de voorbereide 50 milliliterbuis en vul deze op tot 30 milliliter met RPMI. Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer onder een lichtmicroscoop en pas het aantal cellen aan tot twee keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter met RPMI. Zaai één milliliter celsuspensie in elk putje van een zes-well kamer, en incubeer gedurende twee tot vier uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Na incubatie, controleer of de cellen goed hebben gehecht en vervang de RPMI door 1,5 milliliter monomedium. Continueer de incubatie tot maximaal zes dagen tot monocyten differentiëren tot macrofagen. Nadat primaire menselijke macrofagen zijn afgeleid uit de donorbloedmonsters in een zes-well plaat, voeg 500 microliter Accutase toe en incubeer gedurende 40 minuten om de macrofagen los te maken.Voeg vervolgens 500 microliter medium toe en breng over naar een 15-milliliter centrifugeerbuis voor centrifugatie. Was vervolgens de cellen eenmaal met twee milliliter DPBS en tel ze met een Neubauer kamer. Verdun het gewenste aantal macrofagen in 40 microliter collageen I mix, en vortex de buis kort.Voor het wassen van de sferoïden, voeg 300 microliter DPBS toe aan de putjes van een 96-well plaat. Gebruik een blauwe pipettip van één milliliter met een gesneden punt om het steroïd met DPBS te verzamelen. Zodra het steroïd in de tip zakt, duw de pipet kort naar de bodem van de beeldvormingskamer om het tumorsteroïde over te brengen door oppervlaktespanning.Verwijder zoveel mogelijk resterend DPBS dat met het steroïd is overgebracht. Voeg snel 40 microliter collageen I macrofaagmix toe aan de beeldvormingskamer met steroïd. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide onder vochtige omstandigheden om de collageenmix volledig te laten polymeriseren.Na

a-macrophage-tumor-spheroid-co-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

This video demonstrates a method to establish a three-dimensional tumor spheroid and T cell co-culture. An agarose cast with microwells containing tumor spheroids is prepared, followed by the addition of T cells. After incubation, this setup allows studying the interaction of T cells with tumor spheroids in a controlled three-dimensional environment.

A Three-Dimensional Co-culture Model of Infiltrating T Cells in Tumor Spheroids

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Leer een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest voor kankeronderzoek met humane monocyt-afgeleide macrofagen in een 3D collageen I-matrix. Deze methode helpt bij het bestuderen van macrofaaggedrag en tumorcelinvasie.

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

Meer video's verkennen