Name: Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer live beeldvorming van kiembaanstamcellen in de eierstokniche van Drosophila melanogaster met GFP-gelabelde Par-1. Deze methode maakt gedetailleerde observatie van spectrosoomdynamiek gedurende de hele celcyclus mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Acaimo González Reyes en María Olmedo López voor hun nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" van Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" van VI en VII PPIT-Seville University (P. R-R) en "Contrato de Acceso de I+D+i" van VI PPIT-Seville University (P. R-R). We wensen de Company of Biologists Ltd te bedanken voor het vriendelijk verstrekken van rechten om afbeeldingen te delen die zijn aangepast van de originele publicatie (doi:10.1242/DEV.199716).

OPMERKING: Stap 1.4 moet ten minste 2 dagen van tevoren worden uitgevoerd. Stappen 2.1 en 2.2 kunnen 1 dag van tevoren worden gedaan.
1. Pre-experimentele opstelling I
<ol>
	<li>Bereid 100 µL aliquoten van streptomycine/penicilline antibioticummix (10.000 U/mL penicilline en 10 mg/mL streptomycine) voor en bewaar deze bij -20 °C tot gebruik.</li>
	<li>Bereid 15 mL van de volgende oplossingen met gesteriliseerde zuivere water, bewaar ze bij 4 °C en gebruik ze binnen een maand: Natriumbicarbonaat (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 en 0,1% Tween 20.</li>
	<li>Bereid het volgende kweekmedium en oplossing in een laminaire stromingskast voor om besmetting te voorkomen. Gebruik gesteriliseerde filtertips en buisjes.
	<ol>
		<li>Bereid 2 mL aliquoten van onverdunde foetaal bovien serum (FBS) voor en bewaar deze bij -20 °C tot gebruik onder aseptische omstandigheden.</li>
		<li>Bereid Schneider's Drosophila medium aanvullend met 15% FBS en 0,6% streptomycine/penicilline antibioticummix. Bereid 7 mL aliquoten voor en bewaar deze bij 4 °C. Eén aliquot is genoeg voor twee MatTek platen (zie sectie 2).
		<ol>
			<li>Bereid Ringer's oplossing (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35,5 mM Sucrose, 5 mM Hepes in gesteriliseerde zuivere water; pH 6,9). Bereid 1 mL aliquoten voor en bewaar deze bij -20 °C tot gebruik.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verzamel 1-2 dagen oude vliegen die constitutief en ubiquitair het Par-1 eiwit gefuseerd met GFP (poly Ubiquitin-mGFP6::par-1 lijn) tot expressie brengen in een nieuwe buis met vliegvoer aangevuld met gistpoeder. Kweek ze 2 dagen bij 25 °C in een incubator voordat je ze ontleedt. 
	OPMERKING: Deze stap kan worden gedaan met elke fluorescent gelabelde reporter van belang.</li>
</ol>
2. Coating en voorbereiding van glazen bodemplaat
<ol>
	<li>Plaats een druppel van 3 µL van een specifiek Cell-Tak hechtmiddel (hierna cell- en weefselhechtmiddel genoemd) in het midden van de dekglas van een 35-mm poly-D-lysine gecoate plaat (glasbodemplaat, zie Tabel van Materialen) zonder handmatig te verspreiden. Gebruik steriele tips. 
	OPMERKING: Het cell- en weefselhechtmiddel moet bij 4 °C worden bewaard. In het geval van experimenten met twee genetische omstandigheden (typisch, controle- en mutantomstandigheden), plaats twee individuele, goed gescheiden druppels van het hechtmiddel in dezelfde glasbodemplaat. Dit zorgt ervoor dat beide genetische achtergronden onder dezelfde omstandigheden worden afgebeeld.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk daarna een gelijk volume (3 µL in deze protocolopstelling) van 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 voorzichtig toe aan de 3 µL hechtdruppel zoals aanbevolen door de fabrikant en meng door te pipetteren.</li>
	<li>Voor volledige verdamping, incubeer de plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 min en bewaar hem vervolgens bij 4 °C een nacht om de volgende dag te worden gebruikt. Als alternatief, incubeer de voorbereide plaat bij 37 °C gedurende 25 min tot volledige verdamping en ga direct door naar de volgende stap. In beide gevallen, houd de plaat met het deksel. Gebruik steriele tips.</li>
	<li>Laat de voorbereide glasbodemplaat RT bereiken door hem 15-20 min op de werkbank te plaatsen voor gebruik.</li>
	<li>Was de voorbereide plaat 3 keer voorzichtig. Vermijd aanraken en verstoren van de hechtlaag(en). Voeg bij elke wasbeurt 6 µL gesteriliseerde zuivere water toe en verwijder vervolgens het water met een schone tip voor elke van de drie wasbeurten om restanten van de NaHCO3 oplossing te elimineren.</li>
	<li>Laat het water volledig verdampen door de schone en voorbereide plaat bij RT te plaatsen terwijl je dissecteert gedurende 5-10 min met het deksel erop om stofdeeltjes te voorkomen.</li>
</ol>
3. Drosophila eierstokdissectie en eierstokisolatie en montage
OPMERKING: De eierstokdissectie wordt uitgevoerd in Ringer's oplossing (in plaats van Schneider's medium) zonder FBS om de aanwezigheid van eiwitten die de hechting van het monsterweefsel aan het hechtmiddel kunnen verstoren, te voorkomen.
<ol>
	<li>Reinig een drie-putjes dissectiedisch, forceps en dissectienaalden met 70% ethanol voordat je begint.</li>
	<li>Voeg een voldoende volume (~200 µL) van Ringer's oplossing toe aan elk van de drie putjes.</li>
	<li>Dissecteer de eierstokken van 5 gist-gevoede vrouwtjes in 200 µL van Ringer's oplossing in de eerste put met behulp van twee paar forceps volgens standaardprocedures10,11. Grijp de Drosophila vrouwtje bij de kruising van de thorax en abdomen met een van de forceps. Trek vervolgens voorzichtig de cuticula bij de achterste buik en trek de buikcuticula totdat de twee eierstokken worden blootgelegd.</li>
	<li>Breng de gedissecteerde eierstokken over naar de tweede put om besmetting met restanten van andere weefsels of puin dat het gevolg is van dissectie te verminderen.</li>
	<li>Verwijder de spierlaag van 15-20 eierstokken met behulp van een stereomicrosco

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier presenteren we een protocol om de Drosophila melanogaster GSC-niche gedurende een langere periode, tot 16 uur, te monitoren. De meeste protocollen om biologische processen van Drosophila ex vivo te filmen, zijn gericht op kortere tijdsvensters en er zijn meerdere voorbeelden te vinden voor imaginaire vleugelschijven15,16,17, embryo-gonaden18,19 of eierstokken20,21,22,23. Natuurlijk hangt de duur van de beeldverwerving af van het onderzochte ontwikkelingsproces. Terwijl tijdelijke gebeurtenissen kunnen optreden in een bereik dat varieert van milliseconden tot seconden, afhankelijk van het celtype en de fysiologische omstandigheden24, kunnen andere processen, zoals celdeling, uren of dagen filmen vereisen om waarneembaar te zijn. Met name de celcyclus van vrouwelijke Drosophila GSC's duurt ongeveer 12-14 uur om te voltooien25. In Villa-Fombuena et al. (2021)8, was de geschatte duur van de volledige cyclus 15,5 uur, zoals bepaald door de studie van veranderingen in spectrosomemorfologie. De combinatie van deze beeldvormingsmethode met chromatinemarkers en/of de Fly-FUCCI-technologie26 toonde aan dat een GSC zich doorgaans om de 15,5 uur deelde en dat de gemiddelde duur van de celcyclusfasen waren: M (ronde vorm, 22 minuten), G1 (ronde G1, Plug en Bar vormen, 3,45 uur), S (fusievorm, 43 minuten) en G2 (fusie, uitroepteken en ronde vormen, 10,5 uur). Rauwe gegevens over de duur van celcyclusfasen zijn te zien in Villa-Fombuena et al.8. Deze waarnemingen waren consistent met eerdere onderzoeken die vaste beeldvorming gebruikten om de GSC-celcyclus en fusomemorfologie te analyseren25,27,28. Bovendien zou deze in vivo-methode kunnen helpen om de downstream-gevolgen van abnormale GSC-deling en/of spectrosomedynamiek in de downstream-selectie van oöcyten te ontcijferen, aangezien het fusome een belangrijke rol speelt in deze gebeurtenissen. Verder kan dit protocol worden toegepast om de GSC-delingssnelheid in gevestigde of nieuwe mutanten te analyseren.
De continue verwerving van beelden gedurende lange uren brengt een reeks kritieke kwesties met zich mee die moeten worden overwogen, voornamelijk het behoud van de integriteit van het weefsel en zijn functionaliteit en het behoud van de fluorescentie van het monster. Het behoud van de juiste omgevingscondities van nichecellen is essentieel om storingen, stress, celcyclusarrest of celdood te voorkomen. In de omstandigheden van dit onderzoek kunnen GSC's de mitose ingaan, een kritieke stap om de gezondheid van het weefsel aan te geven, zelfs na 12 uur of meer tijdens het filmen. Daarom veronderstellen we dat gekweekte germaria hun integriteit en functionaliteit gedurende het grootste deel van de beeldvormingstijd behouden. Evenzo, vanwege de nieuwe productie van GFP:Par-1-materiaal (zie Villa-Fombuena et al. 2021)8 gedurende de celcyclus, en omdat we de beeldverwerving tot slechts eenmaal per 10 minuten reduceren, behouden zelfs de tijdstippen die dichter bij het einde van de films liggen voldoende signaal om hun analyse mogelijk te maken. In elk geval kan monsterbleken mogelijk worden gecorrigeerd door plug-ins zoals bleekkorrectie13.
Om een goede omgeving ex vivo na te bootsen, kunnen insectenweefsels gedurende een bepaald aantal uur tijdens het filmen met specifieke aanvulling worden gehandhaafd met behulp van Schneider's medium. Belangrijk is dat dit protocol geen groeifactoren of vliegextract gebruikt, behalve FBS. Een eerder onderzoek toonde aan dat veel GSC's normaal gearresteerd zijn in G2 en de M-fase binnengaan door hoge insulineniveaus25. Daarom voegen we geen insuline toe aan de kweekcondities om deze abnormale stimulatie van de GSC-celcyclus te vermijden. Het toevoegen van FBS aan het dissectiemedium kan ook de kans verkleinen dat eicellen aan de pipettepunt of aan de glazen schotel plakken tijdens het overbrengen van de ovariolen21. Ten slotte is het gebruik van antibiotica geschikt voor verlengde films om bacteriële en/of schimmelproliferatie te voorkomen. Overgroei van micro-organismen in de kweekschalen kan de homeostase van het weefsel veranderen en daarom de celdeling beïnvloeden. In dit protocol bevat het medium een mix van antibiotica (meestal aangevuld met 1% (100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine). Evenzo kunnen lange incubaties de efficiëntie van antibiotica beïnvloeden en het vervangen van het medium kan worden overwogen om antibioticaverval te voorkomen.
Drosophila germaria zijn omgeven door een tubulaire spiermantel die noodzakelijk is om te verwijderen om de peristaltiek, roterende en samentrekkende bewegingen die typisch zijn voor dit weefsel te voorkomen29,30. Het verwijderen van deze spiermantel verbetert dus de observatie van reportersignalen, maakt het gebruik van confocale instellingsconfiguraties mogelijk om signaalbleken en fotobeschadiging te minimaliseren en maakt high-time-resolutie beelden mogelijk. Aan de andere kant is de bijdrage van de spiermantel aan de homeostase van het weefsel nog onbekend. Daarom kan het verwijderen ervan op de een of andere manier de normale werking van de GSC-niche beïnvloe

Live beeldvorming van biologische processen is essentieel om direct experimenteel bewijs te verkrijgen. De combinatie van geavanceerde confocale microscopie en de optimalisatie van methodologieën maakt de exploratie van meerdere biologische gebeurtenissen met hoge precisie mogelijk. Het optimaliseren van stappen in protocollen zoals weefselmanipulatie en dissectie, monstervoorbereiding en -bewaring, en microscopie-acquisitie-instellingen is cruciaal om de betrouwbaarheid en robuustheid van de verkregen resultaten te maximaliseren. Hier presenteren we een protocol om monsters voor langdurige beeldvorming te monitoren, dat speciaal is gericht op Drosophila melanogaster eierstokken. De Drosophila melanogaster eierstok is een uitstekend modelsysteem voor de analyse van een breed scala aan ontwikkelingsprocessen. Onder vele andere bevat dit voortplantingsorgaan van de fruitvlieg Drosophila melanogaster een zeer goed gedefinieerde volwassen stamcelnis. Deze GSC-nis ondersteunt de ontwikkeling van de vrouwelijke gameten tijdens de volwassenheid. De Drosophila eierstokken zijn samengesteld uit ongeveer 18 ovariolen, waarin eicellen worden ontwikkeld in het germinarium. In de punt van elk germinarium worden 2-4 GSC's onderhouden in een somatische cellulaire nis, voornamelijk gevormd door een terminaal filament van 8-10 cellen, een rozet van 5-8 cap-cellen en 2-3 anterieure escortecellen (Figuur 1A). Deze somatische nis voorziet de GSC's van essentiële signalen en fysieke ondersteuning om hun stamcelkarakter te behouden, proliferatie te controleren en differentiatie te voorkomen1,2,3,4,5.
De GSC's delen zich normaal gesproken asymmetrisch om een nieuwe stamcel te genereren die contact houdt met de somatische nis en een dochtercel, de cystoblast (CB), die het directe contact met de somatische cap-cellen verliest en differentieert. GSC's en CB's bevatten een zeer dynamisch en cytoplasmatisch orgaan, het spectrosoom, waarvan de belangrijkste functie de correcte oriëntatie van de mitotische spindel is tijdens mitose6. De CB deelt zich 4 keer met onvolledige cytokinese om 16-cellige cysten te ontwikkelen, waarbij een van de kiemcellen zich specificeert tot de eicel en de andere 15 cellen verpleegcellen worden. Het CB-spectrosoom groeit uit tot een vertakte structuur genaamd het fusoom die de 16-cellige onderling verbonden kiemcellen verbindt. Het spectrosoom is verrijkt met kleine blaasjes en skelet-eiwitten zoals de serine-threonine kinase Par-1 en het membraancomponent Hu-li tai shao (Hts)7. Tijdens de GSC-celcyclus groeit het spectrosoom door de toevoeging van nieuw materiaal en verandert het van vorm, waardoor de identificatie van de G1, S, G2 en M fasen mogelijk is (Figuur 1B)8,9.
We hebben onlangs een ex vivo kweekmethode van het Drosophila germinarium geïmplementeerd die beeldvorming van levende GSC's tot 16 uur mogelijk maakt. Omdat deze cellen gemiddeld eenmaal per 15,5 uur delen8, maakt deze methode het filmen van grote delen van de GSC-celcyclus mogelijk. In combinatie met andere tools heeft onze kweekmethode de beschrijving van spectrosoommorfologie tijdens de GSC-celcyclus en de analyse van de duur van de verschillende celcyclusfasen in vivo mogelijk gemaakt 8 (Figuur 1C). Hier bieden we een gedetailleerd protocol van deze uitgebreide live-imagingmethode aan, ondersteund door een stapsgewijze begeleide video die de methodologie beschrijft (Figuur 2).

<table><tbody><tr><td>9-well glass plate</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot;2H2O; Om Ringer's oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>Cel- en weefselkleefstof gebruikt om cellen of weefselsecties aan te hechten aan vele soorten oppervlakken, inclusief plastic, glas, metaal, FEP-polymeer en biologische materialen.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Afmetingen 0,05 mm x 0,02 mm en lengte 11 cm</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Gekwalificeerd, warmte-geïnactiveerd, E.U.-goedgekeurd, Zuid-Amerikaanse oorsprong&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>35 mm Schaal, Nr. 1.5 Dekglas, 10 mm Glasdiameter,&nbsp;Poly-D-Lysine Gecoat</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Om Ringer's oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Magnesium chloride&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Om Ringer's oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>Lichtgewicht, holle roestvrijstalen handgreep; 4 3/4" Lang.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ18 binoculaire&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl; Om Ringer's oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>Celcultuurmedium voor insectencellen</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge;99,5%, poeder</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Om Ringer's oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge;99,5% (GC); Om Ringer's oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Tungsten Dissection Needle</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, Ultra Fijn, 1 Micron Tip (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>voor moleculaire biologie, viskeuze vloeistof</td></tr><tr><td>Yeast powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging-methoden maken de analyse van dynamische cellulaire processen in detail en in real-time mogelijk. Het Drosophila-ovarium is een uitstekend model om de dynamiek van een groot aantal ontwikkelingsprocessen, zoals celdeling, stamcelkarakter, differentiatie, migratie, apoptose, autofagie, cellulaire adhesie, enz., in de loop van de tijd te verkennen. Onlangs hebben we een uitgebreide ex vivo-kweek en live imaging van de vrouwelijke Drosophila GSC-niche geïmplementeerd. Met behulp van een Drosophila-lijn die een GFP::Par-1-transgeen bevat als voorbeeld, stelt deze methode de visualisatie van de asymmetrische deling van de GSC's binnen hun niche mogelijk en de beschrijving van de veranderingen in de spectrosomenmorfologie tijdens de celcyclus. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de ex vivo-kweek van Drosophila germaria, waardoor een langdurige visualisatie van de vrouwelijke GSC-niche mogelijk wordt. Belangrijk is dat dit protocol breed toepasbaar is op live imaging GSC's met meerdere fluorescent gelabelde eiwitten van belang die beschikbaar zijn in stockcentra en/of in de Drosophila-onderzoeksgemeenschap.

Met dit uitgebreide protocol voor live-imaging kunnen we de asymmetrische mitose van vrouwelijke GSC's in hun niche registreren zonder schijnbare biologische verstoringen. Hiervoor gebruiken we germaria die overal het GFP::Par-1-eiwit tot expressie brengen, dat onderscheid maakt tussen vijf verschillende spectrosoommorfologieën gedurende de GSC-celcyclus: Rond, Plug, Bar, Fusing en Exclamation point (Figuur 1B,C). In een meer gedetailleerde beschrijving observeerden we dat het sterke GFP:Par1-signaal van het Round-G2-spectrosoom (Figuur 1C, paneel a) drastisch afneemt tijdens de G2-M-G1-fasen. Belangrijk is dat het gebruik van deze transgene lijn ook de visualisatie van de intrede van de GSC in de mitose mogelijk maakt, aangezien het grootste deel van GFP::Par-1 het spectrosoom verlaat en het cytoplasma vult tijdens de vroege profase (Figuur 1C, paneel b). Bovendien maakt cytoplasmatisch GFP::Par-1 de precieze detectie van de stap van nucleaire enveloppermeatie (NEP)8,14 mogelijk, aangezien het GFP-signaal op dat precieze moment het nucleoplasma binnendringt (Figuur 1C, paneel b). Na de mitose en de hervorming van de nucleaire envelop wordt het GFP:Par1-signaal geleidelijk hersteld in het Round-G1-spectrosoom (Figuur 1C, paneel c). De novo toevoeging van GFP:Par1-materiaal aan het Round-G1-spectrosoom bevordert de vorming van de Plug- (Figuur 1C, paneel d), Bar- (Figuur 1C, paneel e) en Fusing- (Figuur 1C, paneel f) spectrosoommorfologieën. Tot slot maakt de GFP:Par1-marker de visualisatie van het Exclamation point-spectrosoom mogelijk (Figuur 1C, paneel e), als gevolg van de vorming van het midbody, een microtubuli-rijke eiwitstructuur die tijdens de cytokinese wordt gevormd naast de contractiele actomyosine-ring.
<img alt="Differentiatiefasen van kiemlijndestamcellen; spectrosoommorfologie; diagram van cyclusfasen; microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Dynamiek van de spectrosoomcyclus in levende GSC's.(A) Schematisch diagram van de niche van de kiemlijnstamcel (GSC), bestaande uit terminale filamentcellen (TFC's, in blauw), de transitiecel (TC, in rood), kapcellen (CpCs, in paars) en escortcellen (EC's, in grijs). De GSC's (in geel) bevatten een kenmerkend organel genaamd het spectrosoom (in groen). Tijdens de celcyclus van de GSC verandert het spectrosoom van een bolvorm naar een langgerekte vorm en vervolgens weer naar een bol. De GSC deelt zich om een dochtercel te genereren, de cystoblast (CB, in oranje), die het contact met de niche verliest en die ook een bolvormig spectrosoom bevat. De CB deelt zich vier opeenvolgende, synchrone keren met onvolledige cytokinese om cysten van 2, 4, 8 en 16 cellen te produceren die met elkaar verbonden zijn door het fusoom. (B) Diagram dat de verschillende spectrosoomvormen weergeeft die tijdens de celcyclus worden gegenereerd. (B') Verwachte tijd voor observatie van de spectrosoommorfologieën. (C) Beelden op tijdstippen uit een movie van 17 uur die het GFP::Par-1 signaal in de GSC-niche laat zien. Tijdstip 0 min (0') komt overeen met Nuclear Envelope Permeabilization (NEP). Het paneel illustreert vijf verschillende spectrosoommorfologieën (witte en groene pijlpunten): Rond (zowel in G2 als G1; paneel a en c), Plug (paneel d), Bar (paneel e), Fusing (paneel f) en Uitroepteken (paneel e, groene pijlpunt). Deze laatste spectrosoommorfologie behoort tot de tweede GSC (groene stippellijn) getoond bij 70'. GSC's zijn afgebakend door gele en groene stippellijnen. De resulterende CB's na de GSC-deling zijn afgebakend met oranje stippellijnen. Schaalbalk: 10 µm. Panelen A en B zijn met toestemming aangepast van Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Diagram voor isolatie van Drosophila-ovariolen; stappen: MatTek-voorbereiding, dissectie, beeldvorming; biologische methode." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2: Montagemethode van Cell-Tak-lijm voor verlengde live imaging van Drosophila germaria. (1) Stapsgewijs proces voor het voorbereiden van de glazen bodemschaal met de lijm. (2) Overzicht van de dissectie van Drosophila-ovaria in Ringer-oplossing en de voorbereiding van individuele spiervrije ovariolen. (3) Overbrengen van de ovariolen zonder de spierschede naar de glazen bodemschaal. (4) Vul de glazen bodemschaal met aangevuld Schneider-medium. (5) Beeldvorming van germaria gedurende 10 u tot 16 u met behulp van een geïnverteerde confocale microscoop. Deze figuur is met toestemming aangepast naar Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

extended-live-imaging-female-drosophila-melanogaster-germline-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Een protocol voor levende beeldvorming van GFP-gemerkte eiwitten of autofluorescerende structuren in...

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Wij bieden een protocol voor imaging intracellulaire pH van een geslacht epitheliale cel van de stam in levende Drosophila eierstokweefsel. We beschrijven de methoden voor het genereren van transgene vliegen uiten een pH biosensor, mCherry::pHluorin, image de biosensor met behulp van kwantitatieve fluorescentie imaging, standaard curven genereren en fluorescentie intensiteitswaarden omzetten in pH-waarden.

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Hier bespreken we een workflow om levende explant-hersenen van Drosophila melanogaster derde instarlarven voor te bereiden, te ontleden, te monteren en in beeld te brengen om de cellulaire en subcellulaire dynamiek onder fysiologische omstandigheden te observeren.

Live-Cell Imaging van Drosophila melanogaster Derde Instar Larvale Hersenen

Leer live beeldvorming van kiembaanstamcellen in de eierstokniche van Drosophila melanogaster met GFP-gelabelde Par-1. Deze methode maakt gedetailleerde observatie van spectrosoomdynamiek gedurende de hele celcyclus mogelijk.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Meer video's verkennen