Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden
27 september 2024
Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.
In de afgelopen decennia heeft een explosie van genontdekking honderden genen geïdentificeerd die epilepsie veroorzaken of ermee in verband worden gebracht. De pathogene mechanismen zijn echter niet zo goed onderzocht. Ons laboratorium bestudeert hoe genetische veranderingen de vroege ontwikkeling van de hersenen beïnvloeden en resulteren in hersenmisvormingen en epilepsie, een slopende ziekte die wordt gekenmerkt door chronische aanvallen.
Genetische epilepsie is meestal bestudeerd met behulp van diermodellen, waaronder muizen, zebravissen, drosophila en konijnen. Menselijke stamcellen zijn meer recentelijk gebruikt om genetische epilepsie te modelleren, aangezien technieken om stamcellen in neuroweefsel te differentiëren zijn gevorderd. Met de komst van hersenorganoïden kun je structuuraspecten van de hersenontwikkeling recapituleren.
Het meten van elektrofysiologische activiteit en het bepalen van biomarkers van epilepsiegerelateerde activiteit van hersenorganoïden en assembloids is een uitdaging. Gedeeltelijk is deze techniek beperkt omdat hersenorganoïden geen aanvallen kunnen hebben zoals een intact dier dat kan. Desalniettemin kan het vinden van elektrofysiologische verschillen in dit in vitro-model en reacties op medicamenteuze behandelingen helpen bij het bepalen van pathologische mechanismen en therapeutische reacties bij genetische epilepsieën.
Elektrofysiologische activiteit kan worden beoordeeld met behulp van traditionele opnames van patch-beklimmingen, lokale veldopnames met elektroden en optische technieken zoals calcium- en geheugenspanningsbeeldvorming. Het gebruik van multi-elektrode array-opnames heeft het voordeel dat het mogelijk is om in de loop van de tijd twee opnames te starten en tegelijkertijd vanaf meerdere locaties van een assembloid op te nemen.
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail het stabiel uitplaten van dorso-ventraal gefuseerde assembloïden op multi-elektrode-arrays (MEA's) om epilepsie in vitro te modelleren. Het richt zich op de uitdagingen bij het meten van de elektrofysiologische activiteit en het begrijpen van de pathologische mechanismen van genetische epilepsieën met behulp van brain organoïden afgeleid van menselijke stamcellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Epilepsieonderzoek
- Neuro-ontwikkeling
Achtergrond
- Genetische ontdekkingen hebben talrijke genen geïdentificeerd die geassocieerd zijn met epilepsie.
- Pathogene mechanismen blijven onderbelicht ondanks vorderingen in modellering.
- Menselijke stamcellen en hersenorganoïden zijn naar voren gekomen als modellen voor het bestuderen van genetische epilepsieën.
- Het meten van neuronale activiteit in organoïden is beperkt in vergelijking met intacte diermodellen.
Doel van de studie
- Om een protocol vast te stellen voor het stabiel uitplaten van assembloïden op MEA's.
- Om de elektrofysiologische verschillen te onderzoeken die zijn waargenomen in de in vitro modellen.
- Om de reacties op medicamenteuze behandelingen bij het modelleren van genetische epilepsieën te evalueren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van multi-elektrodearrays (MEAs) voor elektrofysiologische registraties.
- Modellering met dorsaal-ventraal gefuseerde assembloïden afgeleid van menselijke stamcellen.
- Kritieke stappen omvatten de voorbehandeling van het MEA-oppervlak, de voorbereiding van de wells en het plaatsen van de assembloïden.
- Observatie van neuronale rijping in de loop van de tijd met beoordelingen van de netwerkactiviteit.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een toename van de duur van netwerkbursts waargenomen naarmate de neuronen rijpte.
- Veranderingen in cellulaire en netwerkactiviteit werden in de tijd gemonitord en ebben uiteindelijk weg tegen dag 125.
- Het beoordelen van drugrespons kan helpen bij het ontsluieren van pathologische mechanismen van epilepsie.
Conclusies
- Deze studie biedt een robuuste methode voor het in vitro modelleren van epilepsie met behulp van assembloïden op MEA's.
- De bevindingen maken gedetailleerde onderzoeken mogelijk naar de pathologie en behandelingsresponsen van genetische epilepsieën.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van neurale mechanismen die geassocieerd zijn met epilepsie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Hersenassembloïden afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen, geplaatst op multi-elektrodearrays (MEA's), maken longitudinale, niet-destructieve metingen mogelijk van neuronale netwerkactiviteit die relevant is voor epilepsie. Dit platform overbrugt de translationele kloof tussen genetische ontdekkingen en mechanistisch begrip door een schaalbaar, mensspecifiek systeem te bieden voor functionele interrogatie en het profileren van de respons op geneesmiddelen. Deze benadering ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie in een vroeg stadium en informeert risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen voor de ontwikkeling van neurotherapeutica.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Maakt functionele beoordeling mogelijk van genetische varianten die betrokken zijn bij epilepsie met behulp van neurale circuits van menselijke oorsprong.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door fenotypes op netwerkniveau en aberrante activiteitspatronen te onthullen.
- Faciliteert hypothese-gestuurde analyse van de integratie van excitatoire en inhibitoire neuronen.
- Biedt een platform voor het evalueren van de impact van kandidaat-interventies op ziekterelevante netwerkdynamiek.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een robuuste, longitudinale elektrofysiologische assay voor het kwantificeren van netwerkactiviteit over langere perioden.
- Ondersteunt reproduceerbare meting van veldpotentialen, spikes en bursting-patronen in meerdere assembloïden.
- Maakt gestandaardiseerde preparatie van complexe 3D-neurale systemen mogelijk voor downstream compound screening.
- Faciliteert schaalbare, gemultiplexte data-acquisitie voor comparatieve analyse van drugrespons.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro netwerkfenotypes uit met ziekterelateerde biomarkers voor epilepsieonderzoek.
- Biedt continuïteit van genetische ontdekking naar preklinische validatie in een mensspecifieke context.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang van neurotherapeutische kandidaten op basis van functionele read-outs.
- Maakt mechanistische evaluatie van therapeutische interventies mogelijk in een gecontroleerd, schaalbaar systeem.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit op MEA gebaseerde assembloid-platform slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door functionele target-validatie, assay-ontwikkeling en translationele biomarker-afstemming in epilepsiemodellering mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en mechanische risicoreductie door het kwantificeren van effecten op netwerkniveau van genetische of farmacologische perturbaties.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve elektrofysiologische resultaten die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingen en de standaardisatie van assays.
- Analytics: Maakt longitudinale meting van netwerkbursting, rijping en drugrespons mogelijk voor comparatieve analyses.
- Translationeel onderzoek: Stemt in vitro fenotypen af op ziektemechanismen, ter ondersteuning van biomarker-gestuurde preklinische beslissingen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, aanpasbaar platform voor het modelleren van diverse hersengebieden en neurologische aandoeningen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie en vermindert mechanische ambiguïteit in epilepsieonderzoek.
- Operationele waarde: Standaardiseert complexe neurale assays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over R&D-teams heen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door vroeg in de pipeline functionele menselijke data te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van neurotherapeutische activa mogelijk op basis van robuust functioneel bewijs.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamceldifferentiatie, organoïdkweek en het opzetten van elektrofysiologische assays.
- Vereist toegang tot multi-elektrode array-instrumentatie en analytische infrastructuur voor high-content data-acquisitie.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van protocollen voor plating, onderhoud en data-analyse.
- Aanpasbaar voor verschillende hersengebiedspecifieke organoïden, maar kan optimalisatie vereisen voor verschillende weefseltypes.
- Stabiliteit van langetermijnkweek en registratie is cruciaal voor betrouwbare longitudinale studies.
