Levende/dode kleuring voor het kwantificeren van levensvatbare maar niet kweekbare cellen in met Manuka-honing behandelde wondveroorzakende bacteriën

Dit onderzoeksproject heeft tot doel de impact van Manuka-honing op de bacteriële fysiologie te onderzoeken. Recente studies hebben meer inzicht gegeven in de antimicrobiële effecten van Manuka-honing op de bacteriële fysiologie. Onze voorlopige bevindingen geven aan dat Manuka-honingbacteriën in de antibioticaresistente, levensvatbare maar niet kweekbare rusttoestand komen, maar in mindere mate dan degenen die met conventionele antibiotica worden behandeld.

Op basis van onze experimenten zou het interessant zijn om de expressieprofielen van Manuka-honing en conventionele door antibiotica geïnduceerde VBNC's te vergelijken. Neem om te beginnen de injectieflacons met bevroren bacteriestammen. Open ze allemaal achtereenvolgens en gebruik een steriele stok om een kleine hoeveelheid bevroren bacteriën op de correct geëtiketteerde Luria-Bertani- of LB-agarplaat te schrapen.

Plaats de dop van de injectieflacon terug en plaats deze snel in de vriezer. Incubeer de bacterieculturen gedurende 18 tot 24 uur bij 37 graden Celsius. Gebruik de volgende dag een serologische pipet om twee milliliter LB-bouillon over te brengen in twee steriele reageerbuisjes.

Steriliseer de inoculeerlus in de vlam van de bunsenbrander. Breng vervolgens een kwart lus bacteriën van de LB-agarplaat over naar de correct geëtiketteerde reageerbuis met LB-bouillon. Incubeer de reageerbuis onder aërobe omstandigheden in een schudbroedmachine bij ongeveer 250 RPM bij 37 graden Celsius gedurende 18 tot 24 uur.

Voor het opzetten van Manuka-honing en antibioticabehandelingen van bacteriën, voegt u 10 microliter bacteriecultuur toe aan 10 milliliter Mueller Hinton-bouillon om de 1:1.000 verdunning van de bacteriecultuur te verkrijgen, die ongeveer 10 tot de zesde kolonievormende eenheden per milliliter heeft. Gebruik de verdunde culturen om drie monsters voor elke bacteriesoort te bereiden, een onbehandelde controle, een met Manuka-honing behandeld monster en een met antibiotica behandeld monster. Voeg de Manuka honing en het antibioticum toe aan de daarvoor bestemde tubes.

Breng 0,1 milliliter en 0,5 milliliter van het onbehandelde monster over naar steriele microcentrifugebuisjes voor het levensvatbare aantal platen en levend/dood kleuring voor de T is gelijk aan nul monsters. Incubeer vervolgens de onbehandelde controle, met Manuka-honing behandelde en met antibiotica behandelde monsters onder aërobe omstandigheden bij 37 graden Celsius in een schudbroedmachine bij 250 RPM gedurende 24 uur. Bereid een tienvoudige seriële verdunning van het T is gelijk aan nul onbehandeld monster in LB-bouillon om een aftelbaar aantal cellen te verkrijgen voor het levensvatbare aantal platen.

Verdeel 50 microliter van elk verdund monster over de helft van een LB-agarplaat. Incubeer de agarplaten onder aërobe omstandigheden bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag de LB-agarplaten uit de broedmachine.

Identificeer de verdunningsplaat die ongeveer 25 tot 150 kolonies bevat en tel het exacte aantal kolonies. Gebruik de formule van de kolonievormende eenheid om het aantal kweekbare cellen per milliliter te bepalen. Voeg op dag drie 0,5 milliliter 0,85% natriumchloride toe aan 0,5 milliliter T, wat gelijk is aan nul onbehandeld levend/dood kleuringscontrolemonster.

Combineer 1,5 microliter SYTO 9 en 1,5 microliter propidiumjodide per monster. Voeg vervolgens drie microliter van het mengsel toe aan elk monster. Incubeer de monsters 15 minuten bij 21 graden Celsius in het donker.

Breng zes microliter van het bevlekte, voorzichtig gemengde monster over naar een wegwerphemocytometer en bekijk onder een fluorescerende microscoop met behulp van een fluoresceïne-isothiocyanaat- of FITC-filter en een 40x objectieflens. Maak een afbeelding van zowel de rasterlijnen van de hemocytometer als de groene cellen. Tel de groene cellen in zes velden per steekproef en noteer de rasterafmetingen om het aantal groene cellen per volume te berekenen.

Bereken ten slotte het aantal levensvatbare maar niet kweekbare cellen door het aantal kweekbare cellen per milliliter verkregen met behulp van het aantal levensvatbare platen af te trekken van het aantal levensvatbare cellen per milliliter verkregen door levende/dode kleuring. Op dag vier, na het verwijderen van de onbehandelde, met Manuka-honing behandelde en met antibiotica behandelde bacterieculturen uit de incubator, verzamelt u 0,1 milliliter en 0,5 milliliter van elk monster in microcentrifugebuisjes voor het levensvatbare aantal platen en levende/dode kleuring. Deze figuur toont het aantal kweekbare en levensvatbare cellen bepaald aan de hand van het aantal levensvatbare platen en levende/dode kleuring voor S.aureus- en P.aeruginosa-culturen.

De resultaten tonen aan dat het aantal levensvatbare en kweekbare cellen dat werd gedetecteerd in de onbehandelde en met Manuka-honing behandelde culturen niet significant verschilde. S.aureus-culturen behandeld met tobramycine hadden minder kweekbare cellen dan levensvatbare cellen, maar dit verschil was niet significant. Alleen met meropenem behandelde P.aeruginosa vertoonde een statistisch significante vermindering van kweekbare cellen in vergelijking met levensvatbare cellen.