Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device
11 februari 2008
We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.
Hallo, ik ben Kevin won. Ik ben masterstudent in de techniek aan het Biofluids Lab van Cornell University. En vandaag ga ik het hebben over het gebruik van een op agros gebaseerd microfluïdisch apparaat om het effect van EGF epidermale groeifactor op Maureen neuro stamcellen te bestuderen.
Het apparaat bestaat in feite uit drie microfluïdische kanalen, elk 150 microns breed. De EGF wordt in een van de zijkanalen gepompt en de buffer wordt in het andere zijkanaal gepompt. Het creëert in feite een statische lineaire chemische gradiënt over het centrale kanaal.
Aangezien de EGF gemakkelijk diffuseert door het agro-gel, worden de neuron stamcellen in het centrale kanaal gezaaid en wordt de voortgang van hun migratie gemonitord via een microscoop. Dus het apparaat bestaat eigenlijk uit een plexiglas bovenlaag met alle in- en uitlaten voor het aansluiten op de slangen. En daaronder bevindt zich een agro-gelmembraan met vier patroonapparaten erin.
Dit is omgeven door een PDMS-afstandsstuk, wat garandeert dat we constant dikte hebben in het hele apparaat. De PDMS en de gel worden geassembleerd op een glazen plaat, die is gecoat met ect. Dit helpt de cellen om aan de glazen plaat te hechten.
Daarnaast wordt de roestvrijstalen plaat gebruikt om het hele apparaat te monteren en we plaatsen het apparaat samen met schroeven. De wild type cel lijn is getransfecteerd met een retrovirus vector om de wild type EGF receptor over te expresseren en de delta cel lijn is getransfecteerd met een gemuteerde versie van de EGF receptor die het mogelijk maakt om constitutief actief te zijn zonder de EGF ligand. Oké, dus ik ga beginnen met het uitleggen van het assemblageproces van ons microfluïdisch apparaat.
Dus eerst plaatste ik de PDMS-afstandsstuk rond de reliëfkenmerken van de siliconen microkanalen in onze masters. Dus nu ga ik 0,3 gram agros afwegen. Dus nu ga ik 10 ml CO2 onafhankelijk media opbrengen en dat toevoegen aan de agros.
En ik ga op en neer pipetten om het aros poeder met het CO2 onafhankelijke media te mengen. Nu zijn we klaar voor de magnetron. Zoals je nu kunt zien, is de agros nu vloeibaar geworden, maar er zijn nog een paar korrels overgebleven.
Ik zal proberen dit rond te draaien om de korrel op te lossen en van de luchtbellen af te komen. Dus ik giet de gesmolten agros op de reliëfkenmerken van de siliconen master en ik neem nu een steriele glazen plaat en plaats die over de PDMS-afstandsstuk. En ik zet het onder een hoek om te proberen de meeste luchtbellen in het agro-gel naar buiten te duwen.
En ik oefen druk uit en ik zal druk blijven uitoefenen totdat de agros schaal is gestold. Dus na een tot twee minuten is het gestold. Nu ga ik het overtollige agros van de plaat verwijderen.
De volgende stap is om voorzichtig de glazen plaat af te schuiven en deze glazen plaat kan worden weggegooid. Nu ga ik proberen om voorzichtig het patroon aros over te brengen naar een glazen plaat die ik eerder met fibronectine heb gecoat. Ik gebruik eigenlijk dit steriele plastic blad om me te helpen het patroon agros met de PDMM MS-afstandsstuk op te tillen en ik zal het patroon agros met de kanalen naar de plaat overbrengen.
Nu dit stevig op de glazen plaat zit, ga ik gaten in de individuele reservoirs prikken zodat de kunststof verdeler toegang heeft tot de kanalen. Ik doe dit met een kleine metalen gaatjespons. Nu hebben we gaten in het apparaat geprikt.
Ik zal 500 microliter CO2 onafhankelijk media toevoegen om uitdroging van de microkanalen te voorkomen en nu laat ik het een tot twee minuten staan. Oké, na een tot twee minuten zal ik proberen het overtollige media af te tappen en nu ga ik de gaten die ik in het patroon agros heb geprikt, uitlijnen met de in- en uitlaatgaten van de plexiglas verdeler. En zodra de gaten zijn uitgelijnd, druk ik stevig om een mooie afdichting te vormen.
Nu plaats ik de plexiglas verdeler over de roestvrijstalen houders en nu ga ik het apparaat voorzichtig samen zandwichen met schroeven. Ik ben heel voorzichtig om de schroeven niet te strak aan te draaien, omdat dit de kanalen zal uitbuigen en ik plaats de schroeven op kloksgewijze om te voorkomen dat het patroon Agros-gel van binnenuit zal glijden. Ik ga een mil media trekken en ik zal deze spuit gebruiken om het apparaat te testen.
En zoals je kunt zien, injecteer ik vloeistof in elk microkanaal en kijk ik of er vloeistof uit elke uitlaat komt. Dus nu heb ik het geassembleerde apparaat in de omgevingskamer van de microscoop geplaatst. Deze wordt op 37 graden Celsius gehouden, dus dit zal het apparaat opwarmen en het klaar maken voor wanneer we de cellen moeten zaaien.
En zoals je kunt zien, heb ik de twee, de parasolpompslangen al door het apparaat getrokken. En ik spoel momenteel de slangen met PBS ter voorbereiding op onze experimenten. Dus nu gaan we de slangen opzetten.
Ik ga de parasolpompslangen door de doppen met gaten trekken die al in ze zijn geponst. En elke slang heeft een specifiek aantal inkepingen om te kunnen identificeren welke de in- en uitlaat van de slang is. Dus de slang met vier inkepingen krijgt de 10 nanogram per mil.
EGF-oplossing zal nu de slang aan het apparaat bevestigen. Dus ik bevestig het aan elk apparaat volgens hoeveel inkepingen het heeft. Dus het komt overeen met de oplossing die het opneemt.
En nu bevestig ik de uitlaatslang. We gebruiken een heldere tigon slang om ervoor te zorgen dat de media inderdaad door de uitlaatslang stroomt en dat er geen blokkades in het kanaal zijn. En nu ga ik de parasolpompen starten.
Dus nu begin ik de procedure om de cellen in het centrale kanaal te zaaien. Ik begin met het verwijderen van het overtollige media in het sensorkanaal. Dus nu zal ik de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert dat de overexpressie van epidermale groeifactorreceptoren (EGFR) de motiliteit van neurale stamcellen (NSCs) verhoogt met behulp van een nieuw microfluïdisch apparaat op basis van agarosegel. Deze technologie is aanpasbaar aan andere zoogdiercelsystemen waarbij celbronnen schaars zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Microfluidica
Achtergrond
- Epidermale groeifactor (EGF) beïnvloedt het celgedrag.
- Neurale stamcellen (NSCs) zijn cruciaal voor neurale regeneratie.
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige controle van cellulaire omgevingen mogelijk.
- Het begrijpen van de motiliteit van NSCs kan bijdragen aan de regeneratieve geneeskunde.
Doel van de studie
- Om het effect van EGF op de motiliteit van NSC's te onderzoeken.
- Om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen voor het bestuderen van cellulaire reacties.
- Om inzicht te verschaffen in het gedrag van NSC's in een gecontroleerde omgeving.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat op basis van agarosegel.
- Creatie van een statische lineaire chemische gradiënt van EGF.
- Observatie van de motiliteit van NSC's als reactie op blootstelling aan EGF.
- Gebruik van microfluïdische kanalen voor nauwkeurige vloeistofcontrole.
Belangrijkste resultaten
- EGFR-overexpressie verhoogt de motiliteit van NSC's aanzienlijk.
- Het microfluïdische apparaat creëert effectief chemische gradiënten.
- De resultaten wijzen op potentiële toepassingen in regeneratieve therapieën.
- De bevindingen kunnen worden aangepast voor humane neurale stamcellen.
Conclusies
- EGF speelt een cruciale rol bij de motiliteit van NSC's.
- Het ontwikkelde apparaat is een waardevol instrument voor cellulaire studies.
- Toekomstig onderzoek kan worden uitgebreid naar andere celtypen en condities.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De beweeglijkheid van neurale stamcellen dient als een voorspellende biomarker voor tumorigenisch potentieel en ontwikkelingsstoornissen, waardoor een kwantitatieve beoordeling ervan cruciaal is bij targetvalidatie in een vroeg stadium. Het op agarosegel gebaseerde microfluïdische platform maakt reproduceerbare, gradiëntgecontroleerde mobiliteitsassays mogelijk die bijdragen aan het mechanistische de-risking van EGFR-padmodulatoren. Deze benadering vergroot het vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds door receptor-overexpressie te koppelen aan functionele fenotypische uitkomsten in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar EGFR-afhankelijke motiliteit mogelijk als functionele readout voor target engagement in neurale stamcellen.
- Operationele waarde: Biedt een gecontroleerde micro-omgeving om EGFR-signalerings effecten te isoleren van storende variabelen in motiliteitsassays.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt fenotypische screening van EGFR-modulatoren door motiliteitsveranderingen onder gedefinieerde chemische gradiënten te kwantificeren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Assay-gereedheid: Genereert kwantitatieve, optische mobiliteitsmetingen die geschikt zijn voor high-content analyse en compound-screening.
- Reproduceerbaarheid: De fabricage van agarosegels waarborgt een consistente kanaalgeometrie en diffusie-eigenschappen over replicaten heen.
- Schaalbaarheid: Patroonvorming van meerdere apparaten in één enkel gelmembraan maakt parallel testen van meerdere condities of cellijnen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Koppelt de motiliteit van NSC's aan de beoordeling van tumorigenische factoren, ter ondersteuning van preklinische modellen van invasie door hersenkankerstamcellen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of EGFR-overexpressie ligand-onafhankelijke motiliteit aanstuurt, wat informatie verschaft voor de selectie van targets voor inhiberende strategieën.
- Translationele continuïteit: Maakt vergelijking mogelijk tussen wild-type, overgeëxprimeerde en constitutief actieve EGFR-varianten om klinische responsprofielen te voorspellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Het apparaat past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot lead-optimalisatie, en levert fenotypische gegevens op basis van motiliteit die go/no-go-beslissingen informeren voorafgaand aan preklinische investeringen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van de rol van EGFR bij de motiliteit van NSC's door middel van nauwkeurige gradiëntcontrole en real-time imaging.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve motiliteitsresultaten die vergelijking van EGFR-modulerende verbindingen of genetische varianten mogelijk maken.
- Analytiek: Genereert metrieken op basis van trajecten die statistische vergelijking van de motiliteit tussen verschillende condities en cellijnen faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen over motiliteit met de pathofysiologische relevantie in modellen van neurale ontwikkeling en hersenkanker.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het agarosegel-platform is aanpasbaar aan andere zoogdierceltypen, wat standaardisatie tussen projecten bij motiliteitsassays ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in EGFR-signalering door de receptorstatus te koppelen aan functionele motiliteitsfenotypen.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door gestandaardiseerde gelbinding en gradiëntgeneratie via zijkanaalperfusie.
- Strategische waarde: Verbetert de prioritering van targets door functionele validatie te bieden die verder gaat dan bindings- of expressieassays.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van EGFR-gerichte kandidaten mogelijk op basis van op motiliteit gerichte fenotypische risicoreductie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfluïdische assemblage, het hanteren van agarosegel en live-cell imaging onder gecontroleerde perfusie.
- Afhankelijk van toegang tot perfusiepompen, environmental chambers en geïnverteerde microscopen voor time-lapse motility tracking.
- Vereist standaardisatie van de celzaaidichtheid en geldikte om reproduceerbare diffusiegradiënten en adhesie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende celtypen op basis van adhesie-eigenschappen en motilititeitskenmerken op met fibronectine gecoate oppervlakken.
- Beperkt door de optische toegankelijkheid van de gelmatrix en potentiële autofluorescentie die bepaalde fluorescentiegebaseerde read-outs beïnvloedt.
