Karakterisering van biologische absorptiespectra die zich uitstrekken van het zichtbare tot het kortegolf-infrarood

Ons laboratorium ontwikkelt op licht gebaseerde tools die diagnostische informatie bieden voor toepassingen in de gezondheid van moeders. We gebruiken vaak optische spectroscopie vanwege de overvloed aan gezondheidsgerelateerde informatie die het niet-invasief kan bieden, zoals het monitoren van bloedoxygenatie en hemoglobineconcentratie, beide belangrijke fysiologische parameters om tijdens de zwangerschap te controleren. Sommige oplosmiddelen in fijnstof hebben een sterke absorptie die de betreffende opgeloste stoffen kan overschaduwen.

Verder hebben spectra die het VIS-SWIR-gebied overspannen vaak grote verschillen in absorptie bij verschillende golflengtebereiken, en we moeten experimentele instellingen voor verschillende regio's wijzigen om hoge SNL-spectra te verkrijgen. Moeilijkheden bij het verkrijgen van biologische spectra van VIS-SWIR hebben bijgedragen aan beperkte gepubliceerde biologische absorptiespectra, en we streven ernaar dit proces te vereenvoudigen. Bovendien zal een beter begrip van de specifieke spectrale kenmerken van elke biologische component helpen bij het kiezen van geoptimaliseerde golflengten die huidpigmentatiebias veroorzaakt door sterke melanineabsorptie kunnen minimaliseren.

We hopen dat ons protocol onderzoekers in staat zal stellen om de huidige VIS-SWIR-bibliotheek van biologische absorbers uit te breiden. Deze resultaten benadrukken ook de impact van melanine op optische apparaten als functie van de golflengte en kunnen worden gebruikt om systemen te ontwerpen met minimale huidpigmentatiebias, zoals in de SWIR. Om het zuurstofrijke hemoglobinemonster voor te bereiden met volledig gehepariniseerd menselijk bloed, pipetteert u 1,8 milliliter bloed in een microcentrifugebuis.

Centrifugeer de buis gedurende 9.6 minuten 10 g en gooi ongeveer 850 microliter supernatans weg zonder de pellet te verstoren. Reconstitueer de pellet in ongeveer 850 microliter gedeutereerd water en centrifugeer opnieuw op 9,6 g gedurende 10 minuten. Na de laatste centrifugatie, om rode bloedcellen te lyseren, reconstitueert u de rode bloedcelpellets met 4,5 milliliter gedeutereerd water.

Als de pellet aan de buis blijft kleven, spoel deze dan af met een portie gedeutereerd water om deze los te maken. Verwijder met een naald en spuit met een stompe punt de gelyseerde bloedoplossing uit de buis. Maak vervolgens de naald met stompe punt los van de spuit en gooi deze weg in een container voor biologisch gevaarlijke scherpe voorwerpen.

Bevestig vervolgens een spuitfilter van 0,22 micrometer aan de spuit en filtreer de inhoud in een weglengte van 10 millimeter, een glas van 3,5 milliliter of een kwartscuvet. Zet de cuvet vast met een luchtdichte stop om besmetting te voorkomen. Wikkel parafilm om de stop om een volledig luchtdichte afsluiting te garanderen.

Bereid een referentie voor door een schone cuvet met hetzelfde pad, dezelfde lengte en hetzelfde volume te vullen met gedeutereerd water voor basislijn- en referentiemetingen. Om het zuurstofarme hemoglobinemonster voor te bereiden, voegt u natriumdithioniet toe aan de bloedoplossing in de cuvet. Zet de cuvet vast met een luchtdichte stop en wikkel Parafilm om de stop om een luchtdichte afsluiting te garanderen.

Kantel de cuvet voorzichtig heen en weer totdat het natriumdithioniet volledig is opgelost. Let op de kleurverandering van de bloedoplossing van rood naar donkerder paarsrood. Schakel om te beginnen de spectrometerlamp en detectoren in, zodat het systeem 5 tot 20 minuten kan opwarmen.

Reinig de cuvetten met ethanol met behulp van een Kimwipe. Plaats voor een spectrometer met dubbele bundel cuvetten gevuld met gedeutereerd water als referentieoplossing in zowel de monster- als de referentiekamer. Selecteer het juiste golflengtebereik en de detector op basis van het spectrale gebied dat moet worden gemeten.

Verkrijg referentiemetingen met behulp van de standaardparameters. Vervang vervolgens de cuvet in de monsterkamer door de cuvet met de zuurstofrijke hemoglobine. Schakel over naar de Live-modus om de absorptie continu te bekijken terwijl de meetparameters worden afgestemd.

Begin met de standaard spectrometerparameters en pas de metingen per datum en bandbreedte aan om een kwalitatief schoon absorptiespectrum zonder verzadiging te verkrijgen. Als het wijzigen van het invallende lichtvermogen, de bandbreedte, de belichtingstijd en de metingen per datum niet resulteert in een spectrum met een hoge signaal-ruisverhouding, wijzigt u de monsterconcentratie door de referentiecuvet in het monster of de referentiekamer of de padlengte van het monster en de referentie te plaatsen om een spectrum met een hoge signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Zodra de instellingen voor het monster zijn geoptimaliseerd, documenteert u de instellingen voor elk verkregen spectrum.

Gebruik de geoptimaliseerde instellingen om opnieuw te meten met dezelfde instellingen als de referentieoplossing in de referentie- en monsterkamers om de geoptimaliseerde referentiemeting te verkrijgen. Vervang vervolgens de referentiecuvet in de monsterkamer door de zuurstofrijke hemoglobinemonstercuvet en voer een geoptimaliseerde monstermeting uit. Sla zowel de referentie- als de voorbeeldmetingen afzonderlijk op.

Bereken met behulp van de volgende vergelijking de extinctie A door de referentiemeting te behandelen als I0 en de monstermeting als I. Open voor nabewerking data-analysesoftware zoals MATLAB en laad de absorptiemetingen die zijn verkregen uit verschillende delen van het spectrum. Pas een vermenigvuldigingsfactor toe op één spectraal gebied om verschillende gebieden met verschillende monsterconcentraties of padlengtes aan elkaar te naaien. Het geoxygeneerde hemoglobinespectrum vertoonde een sterke correlatie met een gepubliceerd spectrum van Prahl, met duidelijke absorptiepieken bij 415 nanometer en een doublet tussen 540 en 575 nanometer in het zichtbare gebied, samen met een breed absorptiekenmerk tussen 800 en 1.100 nanometer in het nabij-infrarood.

In het kortegolf-infraroodgebied. Het geoxygeneerde hemoglobinespectrum vertoonde een lage absorptie, waarschijnlijk als gevolg van het restwatergehalte. Het zuurstofarme hemoglobinespectrum vertoonde een sterke correlatie met het spectrum van Prahl, met prominente pieken op 430 nanometer, 560 nanometer en 760 nanometer, en kleinere pieken rond 1.200 nanometer en tussen 1.400 en 1.600 nanometer.