Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen

Dus we bestuderen complexe koolhydraten, of glycanen, in het aangeboren immuunsysteem en immuungerelateerde aandoeningen, met een huidige focus op sepsis en kanker. Ons werk omvat analytische methoden en systemen glycobiologie, inclusief glycomische en glycoproteomische methoden, voor de gedetailleerde karakterisering van de menselijke glycoproteïne. Glycoproteomics heeft enorme vooruitgang geboekt in de afgelopen decennia, en de voortgang wordt niet langer beperkt door de schaarste van beschikbare hoogwaardige massaspectrometriegegevens.

De uitdaging is eerder om biologische kennis te interpreteren en te genereren uit de spectrale gegevens. De glycomische-geleide glycoproteomische methode stelt glycowetenschappers in staat om diep en nauwkeurig inzicht te krijgen in het glycoproteoom en harde barrières met menselijke gezondheidsindices. Glycoproteomics is uniek in staat om locatiespecifiek inzicht in het glycoproteoom te genereren. Maar glycopeptide-tarieven blijven hoog.

Om deze reproduceerbaarheidskwesties aan te pakken, stelt onze glycomische glycoproteomische methode precisie glycoproteoomprofilering mogelijk door beperkingen in de glycan-zoekruimte te definiëren door middel van een glycomische enquête van hetzelfde monster. Uiteindelijk maakt het snellere en nauwkeurigere glycopeptide-zoekopdrachten mogelijk. Onze glycomische-geleide glycoproteomische methode maakt een uitgebreide kaart mogelijk van de heterogeniteit en dynamica van de glycoproteoomindexen vanuit een verscheidenheid aan verschillende menselijke specimens.

Deze methode kan ons daarom helpen met een beter begrip van de ziekteprogressie en kan ons ook helpen nieuwe diagnostische biomarkers te vinden voor therapeutische doelen tegen een breed scala aan menselijke ziekten. De glycomische-geleide glycoproteomische methode stelt ons in staat om de complexiteit van het menselijke glycoproteoom te ontcijferen, wat op zijn beurt nieuwe biologische vragen opent, zoals hoe glycanstructuren de eiwitfunctie, celcommunicatie of immuunreacties beïnvloeden. Het roept ook vragen op over hoe en waarom het glycosylatiepatroon in bepaalde ziekten is veranderd.

En deze inzichten kunnen leiden tot ontdekkingen en nieuwe diagnostische markeringen en gepersonaliseerde therapieën bij complexe ziekten. Om het eiwit van belang op een PVDF-membraan te immobiliseren, gebruikt u een enkele gatpunctie, snijdt u de membraan op basis van het aantal monsters dat moet worden aangebracht. Bevochtig de uitgesneden membranen met methanol en breng ze vervolgens over naar een platte bodem 96-wellsplaat.

Zodra de membranen bijna droog zijn, brengt u 2,5 microliter eiwitmonsters per stip aan. Laat de membranen luchtdrogen bij 20 tot 25 graden Celsius gedurende ten minste drie uur, of bij voorkeur 's nachts, waarbij u voorzichtig bent om besmetting te voorkomen. Voeg 100 microliter 1%PDP-40 in methanol toe aan elke put met de aangebrachte membranen.

Schud de plaat in de PDP-40-oplossing bij 20 tot 25 graden Celsius. Gooi na vijf minuten de PDP-40-oplossing weg. Was vervolgens elke put met de geblokkeerde eiwitspots met 100 microliter ultrapuur water en schud de plaat gedurende vijf minuten.

Voeg 15 microliter PNGase F-oplossing toe aan elke put. Om uitdroging te voorkomen, voegt u water toe aan de omringende lege putten. Sluit de plaat voorzichtig af met transparant film en incubeer gedurende minimaal acht uur bij 37 graden Celsius.

Na incubatie, soniceert u de plaat gedurende vijf minuten om eventuele verdampte druppels aan de zijkanten van de putten te helpen verzamelen aan de onderkant. Breng de vrijgekomen N-glycan-monsters over in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Was elke monstersput twee keer met 20 microliter ultrapuur water, aspireer en combineer alle resterende monsters in de nieuwe buisjes.

Voeg vervolgens 10 microliter van 100 millimolair ammoniumacetaat pH 5 toe en incubeer de monsters gedurende één uur bij 20 tot 25 graden Celsius. Droog de N-glycan-monsters in een vacuüm concentrator systeem. Om zelfgemaakte poreuze grafietkoolstof, of PGC-C18 solid phase extractie, of SPE microkolommen te bereiden, gebruikt u een spuit om C18-schijven in 10-microliter pipettenpunten te pluggen en over te brengen.

Pipetteer een 10 microliter van PGC-harsslurry gesuspendeerd in 50% methanol in de C18 SPE microkolommen. Plaats de microkolommen in 2-milliliter buisjes met microcentrifugeadapters. Draai de buisjes om PGC-C18 SPE microkolommen te maken met een geschatte kolomhoogte van 0,5 centimeter.

Voeg vervolgens 50 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur, of TFA, in acetonitril toe aan de microkolommen en centrifugeer gedurende 60 seconden bij 2000 G om de mobiele fasen door de microkolommen te laten passeren. Was en conditioneer de microkolommen op vergelijkbare wijze drie keer met 0,1% aqueus TFA. Breng de N-glycan-monsters aan op elke microkolom in laadvolumes van maximaal 40 microliter.

Spin de microkolom na elke editie, herhaal tot het hele monster is geladen. Was elke microkolom met 20 microliter ultrapuur water. Breng de microkolommen over naar nieuwe 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes.

Om de N-glycanen te elueren, voegt u 40 microliter van 0,1% TFA in 50% acetonitril toe aan elke microkolom. Draai de buisjes en combineer het eluaat van elke spin. Droog de ontzoutte N-glycanen in een vacuüm concentrator systeem.

Blader door de gegenereerde LC-MS/MS-ruwe gegevens met behulp van geschikte software. Bevestig de hoge gegevenskwaliteit door een smalle LC-piekbreedte, effectieve scheiding van N-glycan-isomeren, hoge MS-nauwkeurigheid, resolutie en signaal-ruisverhouding te beoordelen, samen met hoge CID MS/MS-fragmentatie-efficiëntie. Identificeer handmatig N-glycanen in het monster op basis van mono-isotopische voorlopermassa, CID MS/MS-fragmentatiepatronen en relatieve en absolute PGC-LC-retentietijden.

Voor relatieve N-glycan-kwantificering, genereer een overgangslijst met de mono-isotopische voorlopermassa-op-lading