Name: Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer de glycomics-geleide glycoproteomics methode voor uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het verkrijgen van diepgaande inzichten in kankerglycobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Profilering van colorectale kankerweefsels met behulp van Glycomics-geleide glycoproteomics

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate, zuiverheid &ge;99,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Watervrij acetonitrile (ACN), LC-MS kwaliteit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Bovine fetuïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Formic acid, LC-MS kwaliteit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μL) recombinant uitgedrukt in Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Sequencing-grade varkenstrypsine&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Natriumborohydride (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Triethylammoniumbicarbonaat (TEAB), LC-MS kwaliteit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA), LC-MS kwaliteit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Tools/Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 schijven</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8 schijven</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Vlakbodem polypropyleen 96-well plate&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>Poriegrootte: 0,45 μm&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Microcentrifuge adapters&nbsp;</td><td>The Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin Column Collar, komt met Microspin Columns</td></tr><tr><td>Oligo R3 hars</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>Deelgrootte 30 μm</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind buizen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind buizen 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock buizen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock buizen 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Punsmachine met enkele opening</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb SPE hars</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Deelgrootte 120-400 mesh. Hars kan handmatig uit cartridges worden geëxtraheerd en kan langdurig worden bewaard in 50% (v/v) methanol in MilliQ water</td></tr><tr><td>Spuit 5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Temperatuurgestuurde incubator</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Ultrasoonbad</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>ZIC-HILIC hars</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Deelgrootte/poriegrootte, 5 μm/200 Å. Hars kan handmatig uit LC-kolom worden geëxtraheerd en kan langdurig worden bewaard in 50% (v/v) methanol in MilliQ water</td></tr><tr><td>ZipTip C18 solid-phase extractie (SPE) micro-kolommen&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>Alternatief, zelfgemaakte C18-SPE micro-kolommen kunnen commercieel product vervangen</td></tr><tr><td>LC-MS/MS Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Capillary HPLC systeem&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Analytische LC-kolom voorgevuld met ReproSil-Pur C18 AQ hars</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Duitsland</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Deelgrootte/poriegrootte: 3 μm/120 Å, lengte/binnendiameter: 25 cm/75 μm. Commerciële C18 nano-LC-kolommen ook beschikbaar/&nbsp;</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC Systeem&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>HyperCarb KAPPA PGC capillaire LC-kolom&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Discontinued</td><td>Deelgrootte/poriegrootte, 3 μm/250 Å; kolomlengte, 30 mm; binnendiameter, 0,180 mm. Grotere geometrieën van de HyperCarb PGC-LC-kolommen, die vergelijkbare kwaliteitsgegevens produceren, zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Thermo #35003-031030). SupelTMCarb LC-kolom van Merck met een deelgrootte/poriegrootte, 2,7 μm/200 en met verschillende kolomlengten en interne diameter zijn ook beschikbaar (bijv. Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>LCMS-kwaliteit acetonitrile</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>Alternatieven beschikbaar</td></tr><tr><td>Linear trap quadrupole (LTQ) Velos Pro ion trap massaspectrometer (glycomics)&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>

glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Dus we bestuderen complexe koolhydraten, of glycanen, in het aangeboren immuunsysteem en immuungerelateerde aandoeningen, met een huidige focus op sepsis en kanker. Ons werk omvat analytische methoden en systemen glycobiologie, inclusief glycomische en glycoproteomische methoden, voor de gedetailleerde karakterisering van de menselijke glycoproteïne. Glycoproteomics heeft enorme vooruitgang geboekt in de afgelopen decennia, en de voortgang wordt niet langer beperkt door de schaarste van beschikbare hoogwaardige massaspectrometriegegevens.De uitdaging is eerder om biologische kennis te interpreteren en te genereren uit de spectrale gegevens. De glycomische-geleide glycoproteomische methode stelt glycowetenschappers in staat om diep en nauwkeurig inzicht te krijgen in het glycoproteoom en harde barrières met menselijke gezondheidsindices. Glycoproteomics is uniek in staat om locatiespecifiek inzicht in het glycoproteoom te genereren. Maar glycopeptide-tarieven blijven hoog.Om deze reproduceerbaarheidskwesties aan te pakken, stelt onze glycomische glycoproteomische methode precisie glycoproteoomprofilering mogelijk door beperkingen in de glycan-zoekruimte te definiëren door middel van een glycomische enquête van hetzelfde monster. Uiteindelijk maakt het snellere en nauwkeurigere glycopeptide-zoekopdrachten mogelijk. Onze glycomische-geleide glycoproteomische methode maakt een uitgebreide kaart mogelijk van de heterogeniteit en dynamica van de glycoproteoomindexen vanuit een verscheidenheid aan verschillende menselijke specimens.Deze methode kan ons daarom helpen met een beter begrip van de ziekteprogressie en kan ons ook helpen nieuwe diagnostische biomarkers te vinden voor therapeutische doelen tegen een breed scala aan menselijke ziekten. De glycomische-geleide glycoproteomische methode stelt ons in staat om de complexiteit van het menselijke glycoproteoom te ontcijferen, wat op zijn beurt nieuwe biologische vragen opent, zoals hoe glycanstructuren de eiwitfunctie, celcommunicatie of immuunreacties beïnvloeden. Het roept ook vragen op over hoe en waarom het glycosylatiepatroon in bepaalde ziekten is veranderd.En deze inzichten kunnen leiden tot ontdekkingen en nieuwe diagnostische markeringen en gepersonaliseerde therapieën bij complexe ziekten. Om het eiwit van belang op een PVDF-membraan te immobiliseren, gebruikt u een enkele gatpunctie, snijdt u de membraan op basis van het aantal monsters dat moet worden aangebracht. Bevochtig de uitgesneden membranen met methanol en breng ze vervolgens over naar een platte bodem 96-wellsplaat.Zodra de membranen bijna droog zijn, brengt u 2,5 microliter eiwitmonsters per stip aan. Laat de membranen luchtdrogen bij 20 tot 25 graden Celsius gedurende ten minste drie uur, of bij voorkeur 's nachts, waarbij u voorzichtig bent om besmetting te voorkomen. Voeg 100 microliter 1%PDP-40 in methanol toe aan elke put met de aangebrachte membranen.Schud de plaat in de PDP-40-oplossing bij 20 tot 25 graden Celsius. Gooi na vijf minuten de PDP-40-oplossing weg. Was vervolgens elke put met de geblokkeerde eiwitspots met 100 microliter ultrapuur water en schud de plaat gedurende vijf minuten.Voeg 15 microliter PNGase F-oplossing toe aan elke put. Om uitdroging te voorkomen, voegt u water toe aan de omringende lege putten. Sluit de plaat voorzichtig af met transparant film en incubeer gedurende minimaal acht uur bij 37 graden Celsius.Na incubatie, soniceert u de plaat gedurende vijf minuten om eventuele verdampte druppels aan de zijkanten van de putten te helpen verzamelen aan de onderkant. Breng de vrijgekomen N-glycan-monsters over in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Was elke monstersput twee keer met 20 microliter ultrapuur water, aspireer en combineer alle resterende monsters in de nieuwe buisjes.Voeg vervolgens 10 microliter van 100 millimolair ammoniumacetaat pH 5 toe en incubeer de monsters gedurende één uur bij 20 tot 25 graden Celsius. Droog de N-glycan-monsters in een vacuüm concentrator systeem. Om zelfgemaakte poreuze grafietkoolstof, of PGC-C18 solid phase extractie, of SPE microkolommen te bereiden, gebruikt u een spuit om C18-schijven in 10-microliter pipettenpunten te pluggen en over te brengen.Pipetteer een 10 microliter van PGC-harsslurry gesuspendeerd in 50% methanol in de C18 SPE microkolommen. Plaats de microkolommen in 2-milliliter buisjes met microcentrifugeadapters. Draai de buisjes om PGC-C18 SPE microkolommen te maken met een geschatte kolomhoogte van 0,5 centimeter.Voeg vervolgens 50 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur, of TFA, in acetonitril toe aan de microkolommen en centrifugeer gedurende 60 seconden bij 2000 G om de mobiele fasen door de microkolommen te laten passeren. Was en conditioneer de microkolommen op vergelijkbare wijze drie keer met 0,1% aqueus TFA. Breng de N-glycan-monsters aan op elke microkolom in laadvolumes van maximaal 40 microliter.Spin de microkolom na elke editie, herhaal tot het hele monster is geladen. Was elke microkolom met 20 microliter ultrapuur water. Breng de microkolommen over naar nieuwe 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes.Om de N-glycanen te elueren, voegt u 40 microliter van 0,1% TFA in 50% acetonitril toe aan elke microkolom. Draai de buisjes en combineer het eluaat van elke spin. Droog de ontzoutte N-glycanen in een vacuüm concentrator systeem.Blader door de gegenereerde LC-MS/MS-ruwe gegevens met behulp van geschikte software. Bevestig de hoge gegevenskwaliteit door een smalle LC-piekbreedte, effectieve scheiding van N-glycan-isomeren, hoge MS-nauwkeurigheid, resolutie en signaal-ruisverhouding te beoordelen, samen met hoge CID MS/MS-fragmentatie-efficiëntie. Identificeer handmatig N-glycanen in het monster op basis van mono-isotopische voorlopermassa, CID MS/MS-fragmentatiepatronen en relatieve en absolute PGC-LC-retentietijden.Voor relatieve N-glycan-kwantificering, genereer een overgangslijst met de mono-isotopische voorlopermassa-op-lading

glycomics-guided-glycoproteomics-facilitates-comprehensive-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Diepgaande analyses van kankercel-proteomen vergemakkelijken de identificatie van nieuwe doelen voor geneesmiddelen en diagnostische biomarkers. We beschrijven een experimentele workflow voor kwantitatieve analyse van (fosfo-)proteomen in kankercelsubpopulaties afgeleid van vloeibare en vaste tumoren. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën te combineren met kwantitatieve Super-SILAC-gebaseerde massaspectrometrie.

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Dit artikel presenteert een verbeterde vorm van een nieuwe bottom-up glycomische techniek die is ontworpen om het gepoolde samenstellingsprofiel van glycanen in niet-gefractioneerde biofluiden te analyseren door de chemische afbraak van glycanen in hun samenstellende bindingsspecifieke monosacchariden voor detectie door GC-MS. Mogelijke toepassingen omvatten vroege detectie van kanker en andere glycan-beïnvloedende aandoeningen.

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Dit protocol illustreert hoe menselijke eiwitglyomen kunnen worden verkend, vergeleken en geïnterpreteerd met online bronnen.

Bioinformatica Bronnen voor de Studie van Glycan-Gemedieerde Eiwit Interacties

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

Dit protocol bereidde met succes voldoende hoogwaardig neovasculair weefsel van gliomamonsters met behulp van laser-capture microdissectie voor kwantitatieve proteomics-analyse van tumorangiogenese, waarmee de beperkingen van studies die traditioneel vooral op angiogene factoren gericht zijn overwonnen en een grootschalig proteomica-profiel van glioma-angiogenese werden geleverd.

Voorbereiding van neovasculaire weefsels uit humane gliomaweefsels voor kwantitatieve proteomanalyse van tumorangiogenese

Leer de glycomics-geleide glycoproteomics methode voor uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het verkrijgen van diepgaande inzichten in kankerglycobiologie.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen (Video) | JoVE Journal

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen

Meer video's verkennen