Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen
13 december 2024
Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.
We bestudeerden onze kanalen met betrekking tot temperatuursensatie, leeftijdssensatie en de pijnsensatie. We zijn geïnteresseerd in het screenen van kleine moleculen in onze kanalen en de studie van hun mechanismen. We hebben twee TRPV1-activerende agonisten gescreend en een gedetailleerde studie uitgevoerd naar hun werkingsmechanismen.
Deze technologie maakt realtime, kwantitatieve en gelijktijdige monitoring van calciumveranderingen in meerdere cellen mogelijk, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen. We streven ernaar om het behandelingsmechanisme van traditionele Chinese medicijnen voor de verschillende ziekten te onderzoeken door de modernisering van calciumgerelateerde ionkanalen. Bereid om te beginnen steriele glazen dia's met een diameter van acht millimeter voor en plaats ze op een plaat met 24 putjes.
Voeg 500 microliter Poly-D-lycine buffer toe aan elk putje. Incubeer de objectglaasjes gedurende een uur bij 37 graden Celsius om ze te coaten. Gooi vervolgens met behulp van een pipet de coatingoplossing uit elk putje.
Was de dia's één keer met Dulbecco's PBS en leg de gewassen dia's opzij voor later gebruik. Zaai de cellen op de voorbereide plaat met 24 putjes met een dichtheid van ongeveer 1,5 keer 10 tot de macht van 5 cellen per putje en plaats de plaat in de broedmachine totdat de cellen gaan kleven. Meng vervolgens de Fura-2/AM-stockoplossing en Pluronic F-127 met de buffer van Hank die 1,3 millimolaire calciumionen bevat.
Dek de Fura-2/AM-werkoplossing met aluminiumfolie af om deze tegen licht te beschermen. Voor de voorbehandeling van de cellen brengt u de glasplaatjes met de cellen over op een nieuwe plaat met 24 putjes met de buffer van Hank. Gooi met behulp van een pipet de buffer uit elk putje weg en voeg 500 microliter Fura-2/AM werkbuffer toe aan elk putje.
Incubeer de plaat 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker om de sonde te kunnen laden. Verwijder vervolgens de Fura-2/AM werkbuffer uit elk putje en was de cellen drie keer met Hank's buffer om overtollige Fura-2/AM te verwijderen. Verkrijg om te beginnen de voorbehandelde cellen voor calciumbeeldvorming met één cel en start alle componenten van de fluorescentiemicroscoop.
Open de fluorescentiebeeldvormingssoftware uit de beschikbare opties. Selecteer het gewenste protocol en klik op Oké. Kies vervolgens Nieuw experiment in het hoofdmenu om een nieuwe experimentele installatie te starten.
Monteer nu de perfusiekamer op de microscooptafel en plaats de met Fura-2/AM behandelde objectglaasjes voorzichtig in de kamer met Hank's bufferoplossing. Pas de scherpstelling aan onder wit licht voor een optimale weergave. Selecteer Focussen op het configuratiescherm van het experiment.
Kies de gewenste golflengte voor het scherpstellen, zoals 380 nanometer, en klik op Start Focusing om de brandpuntsaanpassingen te starten. Pas de focus op de cellen aan met behulp van Ruwe focus om het doel dichtbij te halen, gevolgd door Focus zoeken voor nauwkeurige aanpassingen. Observeer de expressie van het doeleiwit door golflengten van FITC of TRITC.
Klik vervolgens op Stoppen met scherpstellen en sluit het scherpstelpaneel. Klik op Experiment configureren in de taakbalk en selecteer de gewenste verdiepingen voor beeldvorming in de configuratie-instellingen. Klik nu op de knop Regio in de menubalk om gebieden voor beeldvorming te definiëren en kies het type Gewenste verlichting voor beeldvorming.
Klik op Afbeeldingen verkrijgen en druk vervolgens op OK om afbeeldingen vast te leggen. Identificeer de gewenste cellen die het doeleiwit onder fluorescentie tot expressie brengen, rekening houdend met de blanco-waarde met de bedieningselementen onder de 380 nanometer. Om een geselecteerde regio ongedaan te maken, klikt u met de rechtermuisknop op de cirkel en selecteert u Regio verwijderen.
Open het menu Verwijzingen, vink het vakje aan voor Verwijzingen aftrekken en klik vervolgens op OK om aftrekken op de achtergrond toe te passen. Klik in het configuratiescherm van het experiment op Loggegevens om de experimentgegevens vast te leggen. Stel in het gedeelte Time Lapse van het configuratiescherm het interval voor gegevensverzameling in op één seconde.
Klik vervolgens op Zero Clock en Acquire in het configuratiescherm van Experiment om de gegevensverzameling te starten. Pas nu behandelingen toe op de cellen volgens de vereisten. Zodra de gegevensverzameling is voltooid, klikt u op Pauzeren om het proces te stoppen.
Sla de verkregen gegevens op en ga verder met de analyse. Als u het experiment wilt beëindigen, klikt u op Bestand en selecteert u Experiment sluiten. Sluit ten slotte de software en breng alle opgeslagen gegevens over van de computer.
Primaire keratinocyten geladen met de Fura-2-sonde vertoonden zichtbare celmorfologie op een golflengte van 380 nanometer. De thermische respons van keratinocyten vertoonde een toename van de intracellulaire calciumionenconcentratie tijdens verhitting met een vergelijkbare respons waargenomen tijdens afkoeling. De thermische respons werd opgeheven in keratinocyten, waarbij het STIM1-gen ontbrak dat de rol van het gen in thermische calciumsignalering aangeeft.
HEK293T cellen die STIM1/Orai1 te veel tot expressie brachten, vertoonden een opmerkelijke thermische respons bij afkoeling, wat een succesvolle genexpressie bevestigt, zoals blijkt uit groene en rode fluorescentiemarkers. De door de winkel bediende calciumingangsrespons in de cellen tot overexpressie van STIM1-Orai1 werd effectief geïnduceerd door opeenvolgende veranderingen in de extracellulaire calciumconcentratie en de cyclopiazonzuureditie via profusie. Rechtstreeks pipetteren van capsaicine, een TRPV1-agonist, veroorzaakte extracellulaire calciuminstroom in de cellen die het TRPV1-plasmide tot expressie brengen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van single-cell Ca2+-imaging met de Fura-2/AM-kleurstof. De techniek is effectief voor het onderzoeken van temperatuur- en pijnsensatiekanalen, waarbij efficiënte belading van de kleurstof en een nauwkeurige berekening van de Ca2+-niveaus mogelijk zijn via fluorescentie-intensiteitsratio's.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Calciumsignalering
Achtergrond
- Onderzochte kanalen gerelateerd aan temperatuurperceptie en pijn.
- Screening van kleine moleculen die TRPV1-kanalen beïnvloeden.
- Real-time monitoring maakt gelijktijdige observatie van meerdere cellen mogelijk.
- Veranderingen in de calciumionconcentratie zijn cruciaal voor het begrijpen van sensorische mechanismen.
Doel van de studie
- Om de mechanismen van TRPV1-activerende agonisten te verkennen.
- Om de behandelingsmechanismen van traditionele Chinese geneesmiddelen via calciumgerelateerde ionkanalen te bestuderen.
- Om een snelle benadering te bieden voor onderzoekstoepassingen in cellulaire responsen.
Gebruikte methoden
- Single-cell imagingtechniek met gebruik van Fura-2/AM-kleurstof.
- Celculturen van keratinocyten en HEK293T-cellen die eiwitten overexpresseren die gerelateerd zijn aan calciumsignalering.
- Incubatie- en behandelingsprotocollen voor het laden van de kleurstof en data-acquisitie.
- Fluorescentiemicroscopie werd aangewend voor het monitoren van cellulaire responsen.
Belangrijkste resultaten
- Keratinocyten vertoonden verhoogde intracellulaire calciumconcentraties tijdens verwarming en afkoeling.
- De responsen waren gekoppeld aan de aanwezigheid van het STIM1-gen, wat de rol ervan in thermische calciumsignalering benadrukt.
- TRPV1-agonisten triggerden een significante calciuminstroom in gemanipuleerde cellijnen.
- Effectieve calciumsignaleringspaden werden aangetoond voor potentieel therapeutisch onderzoek.
Conclusies
- De studie demonstreert een robuuste methode voor het monitoren van calciumion-dynamiek in levende cellen.
- Het vergroot het begrip van sensorische kanalen bij pijn- en temperatuurregulatie, wat essentieel is voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.
- De algemene implicaties omvatten betere inzichten in neuronale mechanismen en potentiële toepassingen in ziektemodellen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Single-cel calcium imaging met Fura-2/AM maakt real-time, kwantitatieve beoordeling mogelijk van de activatie van calciumionkanalen in reactie op diverse stimuli, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie in de vroege discoveryfase. Deze aanpak levert high-content, gemultiplexte data die cruciaal zijn voor targetvalidatie en functionele karakterisering van ionkanalen die betrokken zijn bij sensorische pathways. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen bij belangrijke omslagpunten in drug discovery-portfolio's voor ionkanalen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe bevraging van calciumkanaal-activeringsmechanismen onder gecontroleerde stimulatie mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van endogene en overgeëxpresseerde ionkanaal-targets.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door genetische of farmacologische verstoringen te koppelen aan kwantitatieve cellulaire responsen.
- Biedt gemultiplexte data met resolutie op enkelcelniveau voor een robuust vertrouwen in de target.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor de ontwikkeling en optimalisatie van assays.
- Maakt reproduceerbare meting van de calciumflux in reactie op kleine molecuulagonisten of -antagonisten mogelijk.
- Ondersteunt de screeningparaatheid door gelijktijdige monitoring van meerdere cellen en condities mogelijk te maken.
- Genereert gegevens in .XLSX-formaat voor gestroomlijnde downstream-analyse en integratie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt functionele read-outs uit met ziekterelateerde pathways, zoals pijn- en temperatuursensatie.
- Maakt continuïteit mogelijk van cellulaire modellen naar preklinische validatie van ionkanaalmodulatoren.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door cellulaire responsen op kandidaat-therapeutica te kwantificeren.
- Biedt mechanistische inzichten voor risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Integratie van pipeline en workflow
Deze workflow voor calcium-imaging op single-cell niveau slaat een brug tussen vroege ontdekking, assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek naar ionkanaal-targets.
- Discovery Biology: Kwantitatieve calcium-imaging ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden voor sensorische ionkanalen.
- Screening: Gestandaardiseerde fluorescentieverhoudingsmetingen maken reproduceerbare evaluatie van verbindingen en schaalbaarheid van assays mogelijk.
- Analytics: Real-time, kwantitatieve outputs faciliteren statistische vergelijking van experimentele condities en mechanistische interpretatie.
- Translational Research: Functionele gegevens over kanaalactivatie informeren de selectie van preklinische modellen en de afstemming van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Het imaging-platform en de analyse-pipeline zijn aanpasbaar voor diverse ionkanaal-targets en celsystemen.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van ionkanaal-targets.
- Operationele waarde: Stroomlijnt data-acquisitie, standaardisatie en reproduceerbaarheid over verschillende experimenten heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door vroeg in de pipeline robuuste functionele gegevens te verschaffen.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van ionkanaalmodulatoren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot gekalibreerde beeldvormingsinstrumentatie en compatibele analysesoftware.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het laden van probes, stimulatieprotocollen en gegevensverwerking.
- Aanpasbaar aan diverse celtypen die endogene of recombinante ionkanalen tot expressie brengen.
- Potentiële beperkingen omvatten fotobleken en de noodzaak van zorgvuldige controle van de efficiëntie van het laden van de probes.
