Registratie van naar binnen rectificerende K^+- stromen in vers geïsoleerde gladde spiercellen van de arteria basilaris door middel van patch-clamp-techniek

Mijn onderzoek richt zich voornamelijk op cardio cerebrovasculaire elektrofysiologie. Deze studie beschrijft een methode voor het isoleren van primaire vasculaire spiercellen en het gebruik van knijpklemtechnologie voor hele cellen om hun elektrofysiologische eigenschappen te ondersteunen. Isolatie van verse cellen heeft beperkingen, zoals de impact van temperatuur op enzymscheiding, variërende verteringstijden voor verschillende bloedvaten en onmiddellijk vermogen in de oorspronkelijke omgeving van de cellen.

Bovendien brengt de knijpklemtechnologie uitdagingen met zich mee bij plafond- en membraanbreuken, wat een vakkundige bediening vereist. Dit protocol faciliteert het onderzoek is in het gemakkelijk verkrijgen van actieve primaire cellen uit handmatige slagaders en moet snel de toepassing van de knijpklemtechniek afremmen. Vul om te beginnen een petrischaal met een koude fysiologische zoutoplossing verzadigd met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide.

Plaats een geïsoleerd rattenbrein in het petrischaaltje. Plaats de hersenen ventraal omhoog in de petrischaal en zet ze vast met naalden. Zoek onder een lichtmicroscoop de basilaire slagader.

Verwijder met een autoclaaf, pincet en schaar voorzichtig het omliggende weefsel. Steek vervolgens een twee centimeter lange draad met een diameter van 25 micrometer in de geïsoleerde basilaire slagader. Wrijf voorzichtig met de draad over de binnenwand van de slagader om het vasculaire endotheel effectief te verwijderen.

Om gladde spiercellen te isoleren, verwarmt u eerst de oplossingen voor in reageerbuizen één tot drie. Breng de geïsoleerde basilaire slagader over naar reageerbuis twee. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius terwijl u continu een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide in de buis injecteert.

Breng vervolgens de basilaire slagader over van reageerbuis twee naar reageerbuis drie en incubeer. Breng één milliliter voorverwarmde celscheidingsoplossing over van reageerbuis één in reageerbuis drie. Ga door met het injecteren van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide terwijl u de enzymatische behandeling gedurende drie minuten handhaaft.

Tritureer het preparaat van de basilaire slagader om cellen vrij te maken. Piket vervolgens vier milliliter koude scheidingsoplossing in reageerbuis drie om het enzymatische proces te beëindigen. Centrifugeer het mengsel gedurende zes minuten bij 59 G.

Gooi met een pipet het bovenstaande weg. Voeg vervolgens opnieuw koude scheidingsoplossing toe. Verwijder na de laatste wasbeurt de supernatant.

Laat een milliliter van de celsuspensie over. Bewaar de celsuspensie zes tot acht uur bij vier graden Celsius. Breng 100 microliter van de celsuspensie over in een bad.

Voeg een milliliter extracellulaire vloeistof toe aan het bad en laat het rusten. Zet om te beginnen een micropipet polar aan. Plaats een glazen buis in de polaire.

Selecteer op het bedieningspaneel programma één. Klik op enter en open programma één. Voer nu een hellingstest uit door op het bedieningspaneel op de helling te klikken om de warmtewaarde van de glazen buis te meten.

Plaats een nieuwe glazen buis. Selecteer vervolgens programma één en klik op enter om de micropipet te fabriceren. Om de zorgstroom vast te leggen, start u eerst de data-acquisitiesoftware.

Selecteer bestand en klik vervolgens op ingestelde bestandsnamen om een pad voor gegevensopslag tot stand te brengen. Schakel de membraantestfunctie in het gereedschapsmenu in. Plaats een monster van geïsoleerde gladde spiercellen uit de basilaire slagader van een rat in het midden van het camerabeeld van een microscoop.

Dompel de punt van de referentiedraad onder in de badoplossing. Vul vervolgens 20% van de gefabriceerde micropipet met de intracellulaire oplossing. Bevestig de geladen micropipet op de opname-elektrodehouder.

Oefen nu met een spuit positieve druk uit. Beweeg de pipetpunt in de badoplossing en pas de pipetoffset op de signaalversterkersoftware aan om de huidige basislijn in te stellen op nul picoampère. Druk de pipet voorzichtig tegen het celmembraan.

Observeer een toename van de afdichtingsweerstand tegen ten minste één magome. Verwijder de overdruk en oefen onderdruk uit. Om een hoge weerstand tot stand te brengen, met een afdichtingsweerstand van ten minste één giggome, stelt u de houdspanning in op min 60 millivolt en compenseert u de elektrodecapaciteit met behulp van CP FAST en CP slow.

Oefen korte onderdruk uit om het celmembraan te scheuren en een hele celconfiguratie te vormen. Selecteer de hele cel in de signaalversterkersoftware. Klik vervolgens op auto voor compensatie van de membraancapaciteit.

Laad het kir-protocol en begin met het opnemen van gegevens. Vers geïsoleerde gladde spiercellen met spoelmorfologie werden geïsoleerd. De cellen waren gezond en geschikt voor experimenten met patchklemmen.

Een typische uithardingsstroom vertoonde inwaartse gelijkrichting bij negatieve spanningen met minimale of geen kaliumionenstroom bij positieve spanningen. Bariumchloride in concentraties van 100 tot 300 micromol per liter remde effectief de activiteit van het kirkanaal, wat de stroom als kir bevestigde. Natriumnitroprusside verhoogde de kirstroom, wat wijst op de rol van kirkanalen bij door SNP geïnduceerde vasodilatatie.

Vergelijking van stroomspanningsrelaties toonde een afname van de stroomdichtheid in aanwezigheid van bariumchloride en een toename met SNP.