Massacytometrie-analyse van systemische en lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom

Massacytometrie stelt ons in staat om zowel systematische als lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom te analyseren. Door immuuncellen op het niveau van één cel te profileren, identificeren we unieke subsets en de functionele toestanden die verband houden met tumorprogressie, en bieden we inzicht in immuunontwijkingsmechanismen en de potentiële therapeutische doelen voor gepersonaliseerde behandelingen. Ons protocol maakt gebruik van massacytometrie om meer dan 14 markers tegelijkertijd op eencellig niveau te analyseren, waardoor spectrale overlapping wordt vermeden die wordt gezien in traditionele flowcytometrie. Dit omvat nauwkeurige identificatie van echte celpopulaties en levert hoogdimensionale gegevens op voor gedetailleerde immuunprofilering en de ontdekking van biomarkers.

[Verteller] Ontdooi om te beginnen de bevroren perifere mononucleaire bloedcel en de hepatocarcinoomcelsuspensies. Resuspendeer de cellen na celherstel in één milliliter PBS zonder calcium en magnesium. Voeg cisplatine toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 micromolair, meng goed en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Om de reactie te stoppen, centrifugeert u de buisjes gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 500 G. Gooi het supernatant weg en voeg vervolgens een milliliter celkleuringsbuffer toe aan elk buisje. Nadat u opnieuw hebt gecentrifugeerd, gooit u de supernatant voorzichtig weg. Om FC-receptorblokkering uit te voeren, bereidt u eerst een blokmix van 50 microliter voor elk monster en combineert u 48 microliter celkleuringsbuffer met twee microliter FC-blokkerende oplossing. Resuspendeer de celpellet in het blokmengsel en incubeer. Voeg vervolgens 1,1 microliter van elk antilichaam per monster toe aan een geëtiketteerde buis om de membraaneiwitantilichaammix te bereiden. Vul het volume aan tot 55 microliter met celkleuringsbuffer. Breng 50 microliter van het bereide antilichaammengsel over in elke monsterbuis, waardoor het totale volume op 100 microliter komt. Draai de monsters vervolgens voorzichtig om te mengen voordat ze 15 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Voeg een milliliter celkleuringsbuffer toe aan elke monsterbuis. Centrifugeer bij 500 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande weg. Na de laatste wasbeurt wordt de resterende vloeistof kort met de celpellet gevortexeerd om de cellen grondig te resuspen. Voeg voor kleuring van kerneiwitten 500 microliter van de gemengde fixatieoplossing toe aan de geresuspendeerde cellen. Meng de monsters voorzichtig voordat je ze 30 minuten bij kamertemperatuur incubeert. Centrifugeer na de incubatie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 500 G en gooi het bovenstaande weg. Piket vervolgens 1000 microliter permeabilisatiebuffer op elke buis om de cellen te wassen. Centrifugeer de buisjes vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur op 1000 G. Voeg 50 microliter van het antilichaammengsel toe aan elk buisje nadat u het supernatant hebt weggegooid. Pineer de cellen voorzichtig om ze grondig te mengen voordat u ze incubeert. Piket vervolgens 1000 microliter permeabilisatiebuffer op elke buis, centrifugeer opnieuw en gooi vervolgens het supernatant weg. Om de cellen te fixeren, voegt u een milliliter 1,6% formaldehyde bereid in PBS toe aan elke monsterbuis en vortex om de inhoud grondig te mengen. Na 10 minuten bij kamertemperatuur te hebben geïncubeerd, centrifugeert u de monsters en gooit u het bovenstaande weg. Voor nucleaire intercalatiekleuring moet eerst de Cell-ID Intercalator Iridium worden verdund met fix- en permeabilisatiebuffer. Pipetteer een milliliter van de intercalatieoplossing in elk monster. Meng voorzichtig en draaikolk. Plaats de monsters een nacht bij vier graden Celsius en centrifugeer ze vervolgens zoals voorheen. Wanneer de incubatie is voltooid, pipetteert u 1000 microliter celkleuringsbuffer in de buis. Centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 800 G en gooi het supernatant weg. Resuspendeer ten slotte de cellen in 450 tot 900 microliter gedeïoniseerd water. Kleur de cellen met trypanblauw voor het tellen van de cellen voordat u ze verder analyseert. Schakel om te beginnen de massacytometer in en start het programma. Analyseer de monsters in het CyTOF-systeem en verkrijg de massacytometrische gegevens van de perifere mononucleaire bloedcellen en de hepatocarcinoomcelmonsters. Start de gegevensverwerkingssoftware op het instrument en verwerk de CD45+-celpopulatie voor in het FCS-bestand. Verwijder vervolgens dode cellen met behulp van levensvatbaarheidskleuring, zoals cisplatine-uitsluiting. Gate de CD45+-populatie om zich te concentreren op immuuncellen en exporteer de gated populatie voor verdere analyse. Transformeer de data met een co-factor van vijf. Start vervolgens de clusteringsoftware en identificeer de belangrijkste clusters op basis van het SPADE-algoritme, waarbij cellen met vergelijkbare markerexpressieprofielen in clusters worden gegroepeerd. Pas hiërarchische stochastische buurinbedding, of HSNE, toe voor dimensionaliteitsreductie en identificatie van afzonderlijke clusters. Gebruik dan het CyTOF kit pakket in onze software om re-clustering van de belangrijkste clusters uit te voeren. Gebruik het PhenoGraph-programma om subclusters met standaardparameters te identificeren. In totaal werden 14 verschillende celtypen geïdentificeerd in de mononucleaire celmonsters van perifeer bloed. Markerexpressiepatronen voor elk van de 14 celtypen werden gedetailleerd beschreven in de heatmap, met unieke expressieprofielen voor verschillende celpopulaties. De verdeling van deze celtypen varieerde tussen monsters, waarbij monster D een hoger aandeel CD4 T-cellen had, monsters A en B een significante verrijking van B-cellen vertoonden, en CD141+, conventionele dendritische cellen, voornamelijk aanwezig in monster C. Acht celtypen werden geïdentificeerd in de weefselmonsters, waaronder monocyten, T-cellen, neutrofielen, natural killer-cellen, B-cellen, plasmacytoïde dendritische cellen, eosinofielen en myeloïde dendritische cellen. Markerexpressieprofielen voor de weefselceltypen geven verschillende patronen aan voor elke celpopulatie. Weefselmonsters vertoonden een consistent aandeel van de celtypen bij alle patiënten, wat een weerspiegeling is van gedeelde immunologische kenmerken met hepatocellulair carcinoom.