Enzymatische isolatie van interstitiële extracellulaire blaasjes van skeletspieren

Dit protocol heeft tot doel interstitiële extracellulaire blaasjes van skeletspieren in spierweefsels van knaagdieren te isoleren en te zuiveren. Dit extracellulaire blaasje zal onschatbare inzichten verschaffen in het mechanisme van de spiermenselijke status en de ziekte met mogelijke toepassing als diagnostische biomarkers en therapeutische voertuigen. Dit gestandaardiseerde protocol maakt de analyse en vergelijking mogelijk van de kenmerken van EV afkomstig van skeletspieren in verschillende spiermonsters, inclusief de opbrengst, grootte, ladingsamenstelling en functie.

Deze resultaten zullen ons begrip van hun rol in verschillende fysiologische en pathologische processen vergroten, en zullen ook de toepassing van deze EV's als diagnostische biomarkers vergemakkelijken. Ons laboratorium zal zich richten op het betrouwbaar produceren van interstitiële extracellulaire blaasjes met een hoge zuiverheid en een hoog rendement voor skeletspieren op een efficiënte en tijdbesparende manier. We willen hun pathologische rol en therapeutisch potentieel onderzoeken, met name in de context van neuromusculaire aandoeningen.

Zet om te beginnen de geëuthanaseerde muispoot vast in een steriele plaat met de voorkant van het been naar boven gericht. Maak met een dissectieschaar een kleine incisie van vijf millimeter in de huid aan de laterale zijde van de muisenkel. Steek een mes van de schaar in de incisie en plaats deze onder de huid, maar boven het spierweefsel.

Snijd vervolgens de huid omhoog in de richting van de knie om de incisie te verlengen. Gebruik een pincet met een ruw uiteinde om de huid langs de incisie vast te pakken en trek deze terug om de opening te verbreden, totdat de spier zichtbaar wordt. Zoek nu de tibialis anterior, of TA-spier, die loopt van de knie tot de enkel, langs de laterale zijde van het scheenbeen.

Gebruik een geslepen pincet om het bindweefsel dat de TA-spier bedekt vast te pakken en voorzichtig af te pellen. Identificeer in de buurt van de enkel de TA-pees die is verbonden met de TA-spier en de kleinere EDL-pees, die zich naast de TA-pees aan de laterale zijde bevindt. Gebruik een dissectieschaar om beide pezen door te snijden.

Gebruik een ruw pincet om beide pezen vast te pakken. Scheid met een ander pincet voorzichtig de pezen en isoleer de TA van de EDL. Til vervolgens de TA-spier op bij de pas doorgesneden pees met een ruw pincet.

Gebruik een dissectieschaar om de TA-pees bij de knie door te knippen en de spier te verwijderen. Laat nu het been los en draai de muis zodat de achterkant van het been naar boven wijst. Als een deel van de huid al is verwijderd, gebruikt u een dissectieschaar om de resterende huid bij de enkel af te knippen.

Pak de gesneden huid vast met een ruw pincet en pel deze omhoog naar de achterkant van de knie, waardoor de gastrocnemius-spier bloot komt te liggen. Gebruik een dissectieschaar om de gastrocnemiuspees bij de enkel door te snijden. Pak de gastrocnemiuspees vast met een ruw pincet en til deze omhoog om de onderkant van de gastrocnemius-spier bloot te leggen.

Zoek vervolgens de kleinere soleuspees onder de gastrocnemius, dicht bij de knie, waar de gastrocnemius nog steeds is aangesloten. Gebruik een dissectieschaar om de soleuspees door te snijden, zodat de soleusspier naar boven kan samentrekken. Pak de doorgesneden soleuspees vast met een pincet met een scherp uiteinde en til deze voorzichtig op om de soleusspier los te maken van de onderkant van de gastrocnemius.

Gebruik een dissectieschaar om het uiteinde van de soleus af te snijden, waar het zich hecht aan het afgehakte uiteinde van de gastrocnemius, waardoor de twee spieren volledig worden gescheiden. Knip met een dissectieschaar het uiteinde van de gastrocnemius bij de knie af en plaats het in PBS op ijs. Nadat u de vier spieren onder de knie hebt verwijderd, draait u de muis zodat de voorste kant naar boven wijst.

Plaats de muispoot in een hoek van 90 graden om de quadricepsspier te dwingen te buigen. Gebruik een dissectieschaar om de pees die zich het dichtst bij de knie bevindt door te snijden. Om vervolgens de quadriceps van het dijbeen te scheiden, snijdt u tussen de spier en het bot totdat alleen de proximale pees nog vastzit.

Snijd de proximale pees door met een dissectieschaar en verwijder de quadriceps. Spoel alle verwijderde spieren meerdere keren af met PBS om verontreinigingen zoals vacht en bloed te verwijderen. Droog de spieren voorzichtig af met keukenpapier.

Begin met het voorzichtig verwijderen van de pezen van het spiermonster met behulp van een pincet met een scherp uiteinde, een splinterpincet, een scalpel of een schaar. Knip vervolgens met een schaar of een scalpel de spier in de lengterichting langs de spiervezels van de ene pees naar de andere, in brokken van een millimeter dik. Om de spijsverteringsenzymbuffer te bereiden, mengt u twee milligram collagenase, twee enzymen per milliliter DMEM met 1%penicilline-streptomycine-oplossing.

Filtreer de oplossing na het mengen door een filter van 0,2 micrometer. Verdeel het spierweefsel in aliquots, elk met 20 milligram spier. Voeg een milliliter van de voorbereide buffer toe aan elk aliquot voor enzymatische dissociatie en incubeer.

Bereid nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor en etiketteer ze. Stel een filter van 0,45 micrometer in door de zuiger van een spuit van vijf milliliter te verwijderen. Schroef de naaf van de spuit in het bovenste uiteinde van het filter van 0.45 micrometer en plaats het onderste uiteinde van het filter in een gelabelde microcentrifugebuis.

Centrifugeer het mengsel vervolgens gedurende 10 minuten op 1000 G en vier graden Celsius om puin te pelleteren. Gebruik een P-200 micropipet om het supernatans in de spuit over te brengen. Nadat u de zuiger weer in de spuit hebt geplaatst, duwt u het supernatans langzaam door het filter, zodat het zich kan verzamelen in de gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Verwijder de zuiger van de spuit weer. Voeg met behulp van een P-200 micropipet ongeveer 200 microliter PBS toe aan de spuit. Plaats de zuiger terug en duw de 200 microliter PBS langzaam door het filter om eventueel achtergebleven supernatans in de gelabelde microcentrifugebuis te spoelen.

Breng de gefilterde oplossing over in nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter, geschikt voor snelheden tot 200.000 G. Plaats de buisjes na het sluiten ervan in de rotor van de micro-ultracentrifuge om ervoor te zorgen dat ze in balans zijn. Zet de micro-ultracentrifuge aan en stel hem in op een uur lang draaien op 100.000 G en vier graden Celsius. Plaats de geladen rotor met de buisjes in de micro-ultracentrifuge.

Sluit het deksel en zet de stofzuiger aan om het proces te starten. Zodra het vacuüm niveau twee bereikt, drukt u op de startknop en wacht u tot het centrifugeerproces is voltooid. Nadat de centrifugeercyclus is voltooid, klikt u op de vacuümknop om de kamer opnieuw onder druk te zetten voordat u de rotor en buizen verwijdert.

Verwijder het supernatans voorzichtig uit elk buisje met behulp van een P-200 micropipet. Gebruik vervolgens dezelfde P-200 micropipet om 50 microliter PBS aan elk buisje toe te voegen.