Ontwikkeling van een koolprotoplastsysteem voor het bestuderen van hypoxietolerantie in brassica
20 september 2024
Dit protocol beschrijft een efficiënt protoplastsysteem voor koolmesophyll. Er werden verschillende zuurstofarme behandelingen getest en het systeem vertoonde een hoge activering van hypoxie-responsieve genen, waardoor studies naar de genetische en moleculaire mechanismen van overstromingstolerantie in Brassicaceae-groenten werden vergemakkelijkt.
We onderzoeken hoe kool op moleculair niveau reageert op een laag zuurstofgehalte. Omdat kool moeilijk te verkrijgen is, ontwikkelen we een systeem met geïsoleerde koolcellen. Door deze reservecellen, ook wel protoplasten genoemd, bloot te stellen aan zuurstofarme omstandigheden, kunnen we hun stressrespons gemakkelijk onderzoeken.
Werken met protoplast dat in oplossing is gesuspendeerd om zuurstofarme reacties te bestuderen, is lastig. De grote uitdaging is om voldoende zuurstof te behouden voor onze controlemonsters. We hebben een manier bedacht om de zuurstof in de vloeistof weg te pompen.
We hebben de methode gevalideerd door middel van reporter-assays van hypoxiemarkers. We hebben verschillende methoden bekeken om met een laag zuurstofgehalte om te gaan en ontdekten dat het zuurstofabsorberende pakket het beste werkt. Het is gemakkelijk te gebruiken en effectief, waardoor het ideaal is om te bestuderen hoe protoplasten zich gedragen in zuurstofarme omstandigheden.
Het bestuderen van het moleculaire mechanisme in bladgewassen onder hypoxie-omstandigheden was een uitdaging vanwege de beperking van de beschikbare hulpmiddelen, maar met de recente vooruitgang hebben we grote vooruitgang geboekt door een koolprotoplastsysteem met hypoxiebehandeling te gebruiken. Deze nieuwe methode helpt ons te begrijpen hoe weinig zuurstof deze planten op moleculair niveau beïnvloedt. In de toekomst zijn we van plan om het protoplastsysteem te combineren met immunoprecipitatie en reportertesten om de moleculaire regulatieroute te illustreren die betrokken is bij kool tijdens overstromingsstress.
Ons doel is om de belangrijkste regulatoren van overstromingstolerantie te identificeren, waarvan we hopen dat we zullen helpen bij het veredelen van een nieuwe koolcultivar met verbeterde overstromingstolerantie. Vul om te beginnen de ronde vierkante gaten van een plugtray met 48 putjes met commercieel plantsubstraat en zaai Fuyudori en 228 koolzaden ongeveer een centimeter diep in het groeimedium. Om 12,5 milliliter enzymoplossing te bereiden, verwarm je een oplossing met 10 millimolaire MES en 0,6 molaire mannitol voor op 55 graden Celsius.
Voeg vervolgens 1,5% cellulase R-10 en 0,75% macerozym R-10 toe. Roer de oplossing en blijf 10 minuten opwarmen op 55 graden Celsius. Laat de enzymoplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
Voeg vervolgens 10 millimolair calciumchloride en 0,1% runderserumalbumine toe. Gebruik een spuitfilter van 0,22 micrometer om de enzymoplossing te steriliseren in een petrischaaltje van negen centimeter. Verzamel na twee tot drie weken groei koolzaailingen in het tweede bladstadium voor mesofylprotoplastisolatie.
Verzamel de tweede nieuw geëxpandeerde echte bladeren van vijf tot acht koolzaailingen. Snijd de bladeren met een scherp scheermesje in reepjes van 0,5 tot 1,0 millimeter. Breng de bladstroken onmiddellijk over in de vers bereide enzymoplossing.
Onderwerp de koolbladreepjes gedurende 30 minuten aan vacuüminfiltratie in het donker. Na vacuüminfiltratie de bladstroken ondergedompeld in de enzymoplossing vier tot 16 uur in het donker bewaren. Verdun de volgende dag de protoplasten-bevattende oplossing met een gelijk volume W5-oplossing om de enzymatische vertering te stoppen.
Om de suspensie van de protoplasten vrij te maken, draait u het mengsel voorzichtig rond op een orbitale schudder. Filtreer vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de protoplastoplossing gedurende twee minuten bij 150 G bij vier graden Celsius.
Voeg 10 milliliter W5-oplossing toe langs de wand van de buis met een debiet van ongeveer één milliliter per seconde om de gepelleteerde protoplasten te wassen. Na de laatste centrifugatie suspendeer je de protoplasten opnieuw in de W5-oplossing en plaats je de buis 30 minuten op ijs. Verwijder vervolgens één milliliter supernatant per keer totdat al het bovenstaande is verwijderd.
Resuspendeer de protoplasten in een voorgekoelde MMG-oplossing met ijs. Meet de protoplastconcentratie met behulp van een hemocytometer. Stel de uiteindelijke concentratie in op 4 keer 10 tot de macht van 5 protoplasten per milliliter met behulp van MMG-oplossing.
Na de isolatie en nachtelijke spijsvertering was de opbrengst van protoplasten 1,04 keer 10 tot de macht 7 voor Fuyudori en 4,00 keer 10 tot de macht van 6 protoplasten per gram vers gewicht voor 228. De efficiëntie van de protoplasttransfectie was meer dan 40% in zowel Fuyudori als 228 cultivars, zoals aangetoond door het GFP-reportergen. Meng na het isoleren van koolprotoplast 100 microliter van 4 keer 10 tot de macht van 4 protoplasten met 10 microliter plasmide en plaats het mengsel 10 minuten op ijs.
Voeg een gelijke hoeveelheid vers bereide PEG-oplossing toe aan de protoplastoplossing en meng voorzichtig. Incubeer het protoplastmengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg vervolgens 440 microliter W5-oplossing toe om de reactie te beëindigen.
Centrifugeer de getransfecteerde protoplasten gedurende twee minuten bij 150 G bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet in 750 microliter met zuurstof verrijkte W5-oplossing. Breng de geresuspendeerde protoplasten over naar een weefselkweekplaat met zes putjes die vooraf is gecodeerd met 1% runderserumalbumine.
Voor zuurstofverbruikende zakgeïnduceerde hypoxie plaatst u een bord met W5-protoplastoplossing in een anaërobe pot van 3,5 liter. Voeg vervolgens twee zuurstofabsorberende verpakkingen toe aan de pot om een hypoxische omgeving te creëren. Na de behandeling centrifugeren de protoplasten gedurende twee minuten bij 150 G bij vier graden Celsius.
Gooi het bovenstaande weg en vries de verzamelde protoplasten in vloeibare stikstof in voordat u overgaat tot de dubbele luciferase-test. Het zuurstofabsorberende pakket induceerde een 7,0-voudige toename van de BoADH1-promotoractiviteit in vergelijking met de controlegroep, wat de hoogste hypoxische respons aantoonde. De activiteit van de BoSUS1L-promotor nam meer dan 5,6 keer toe, waarbij de behandeling met het zuurstofabsorberende pakket de grootste inductie van alle behandelingen vertoonde.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de moleculaire reacties van koolprotoplasten op zuurstofarme omstandigheden, die stress door overstroming simuleren. Door een nieuw protoplastsysteem te ontwikkelen dat de studie van hypoxie-responsieve genen verbetert, wil het onderzoek de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan overstromingstolerantie in Brassicaceae-groenten verduidelijken.
Belangrijkste onderzoeksonderdelen
Onderzoeksgebied
- Plantstressreacties
- Overstromingstolerantie in groenten
- Genetische en moleculaire mechanismen
Achtergrond
- Kool is moeilijk te verkrijgen, wat de noodzaak van een cellulair systeem zoals protoplasten noodzakelijk maakt.
- Onderzoek naar plantenhypoxiereacties is beperkt door beschikbare technieken.
- Inzicht in moleculaire mechanismen kan fokwerkzaamheden voor betere overstromingstolerantie verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een geïsoleerd koolprotoplastsysteem met behulp van enzymatische vertering.
- Blootstelling van protoplasten aan gecontroleerde zuurstofarme omstandigheden om hypoxie na te bootsen.
- Gebruik van reporterassays om de activering van hypoxie-responsieve genen te valideren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van een protoplastsysteem met hoge transfectie-efficiëntie.
- Protoplasten blootgesteld aan zuurstofabsorbeerbehandelingen vertoonden significante toenames in hypoxie-responsieve genregulatie.
- Inductie van belangrijke hypoxiemarkers, gevalideerd door dual luciferase assays.
Conclusies
- De studie benadrukt een effectieve methode om de moleculaire reacties van kool op zuurstoftekort te analyseren.
- Bevindingen kunnen de ontwikkeling van koolvariëteiten met verbeterde tolerantie voor overstromingsstress vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
