Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Mijn onderzoeksactiviteiten richten zich op het begrijpen van de mechanismen die macrofagen resistent maken tegen infectie door HIV, het virus dat verantwoordelijk is voor de aids-pandemie. In het bijzonder richten we ons op de activiteit van het enzym dat sommige HT-1 wordt genoemd en dat de NTP's, de bouwstenen van de virale genomen, afbreekt. Maar dit enzym heeft ook andere activiteiten die we proberen op te helderen.

We hebben een protocol opgesteld om THP1-cellen genetisch te manipuleren. Deze cellen zijn een ingeburgerd surrogaat voor menselijke macrofagen om te bestuderen. Bijvoorbeeld de replicatie van HIV-1.

Deze cellen zijn moeilijk te transfecteren om hun eiwitgehalte te manipuleren. Daarom stellen we methoden op om hun genoom te manipuleren met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie. Van het ontwerp van SG-RNA's tot de validatie van polyklonale en monoklonale populaties.

Ons protocol is gericht op het bereiken van een zeer efficiënte bewerking van een gen dat van belang is in THP1-cellen die zullen worden geëlektropoleerd met voorgemonteerde ribonucleoproteïnecomplexen gemaakt door de Cas9-nuclease-energie-RNA's. In deze benadering is Cas9-activiteit beperkt in de tijd. Dit vermindert de mogelijkheid om doeleffecten te genereren die vaak optreden wanneer lenti-vectoren worden gebruikt.

En in dit geval verlengt Cas9-expressie inderdaad de tijd en kan het daarom schadelijk zijn voor de cel. Om te beginnen vult u elk putje van een kweekplaat met 24 putjes met 500 microliter RPMI 1640-medium zonder antibioticum en aangevuld met 20% warmte geïnactiveerde en gefilterde FBS. Plaats de plaat een nacht in een bevochtigde broedmachine.

Om de droge enkelvoudige geleider of sgRNA's te rehydrateren tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolair, voegt u 10 microliter TE-buffer toe per nanomol sgRNA. Draai de oplossing gedurende 30 seconden en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius om volledige rehydratatie te garanderen. Om de volgende dag de 30 micromolaire werkende sgRNA-oplossing te bereiden, homogeniseert u eerst kort de 100 micromolaire voorraad sgRNA-oplossing met een pipet en verdunt u de stengel vervolgens in nucleasevrij water.

Draai de oplossing gedurende 30 seconden en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun één microliter van elk van de drie, 30 micromolaire sgRNA's werkoplossingen en 0,5 microliter 20 micromolaire Cas9-oplossing in 3,5 microliter resuspensiebuffer R, om de Cas9 sgRNA-ribonucleoproteïnen samen te stellen, voeg een verhouding van één tot negen molaire toe Vortex kort en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Om een onbewerkte controle voor te bereiden, voegt u 0,5 microliter 20 micromolaire Cas9-oplossing toe aan 6,5 microliter resuspensiebuffer R.Vortex kort en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, voegt u vijf microliter resuspensiebuffer R toe aan monsters om een eindvolume van 12 microliter per elektroporatietoestand te verkrijgen. Om THP-1-cellen voor te bereiden na het tellen van de cellen, verzamelt u een volume dat overeenkomt met 0,2 keer 10 tot de macht van zes THP-1-cellen en centrifugeert u ze gedurende vijf minuten bij 336 G bij 20 graden Celsius, zuigt u het bovenstaande op met behulp van een pipet en resorsureert u de pellet in 500 microliter PBS. Centrifugeer opnieuw en suspendeer de celpellet in de 12 microliter ribonucleoproteïne-oplossing.

Om het elektroporatiesysteem in te stellen, plaatst u het pipetstation onder een bioveiligheidskast en plaatst u een elektroporatieslang in de kast, voegt u drie milliliter buffer E van de elektroporatiekit toe aan de elektroporatiebuis. Schakel het elektroporatieapparaat in en gebruik het touchscreen om de elektroporatieparameters in te stellen, voltage op 1.500 volt. Duur tot 10 milliseconden.

En nummer tot drie. Rust de elektroporatiepipet uit met een tip en zuig 10 microliter van de ribonucleoproteïne THP-1-oplossing op. Steek de pipet in de elektroporatiebuis en druk op start op het scherm van het elektroporatieapparaat.

Wacht tot het bericht voltooid is en haal de pipet uit het slangetje. Breng de THP-1-cellen over in een putje van de voorverwarmde kweekplaat met 24 putjes en homogeniseer het monster voorzichtig. Plaats de plaat terug in de bevochtigde broedmachine en laat de cellen 72 uur ongestoord rusten.

Na elektroporatie en celtelling neemt u een volume op dat overeenkomt met 0,1 keer 10 tot de macht van zes THP-1-cellen in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de cellen vijf minuten bij 336G bij 20 graden Celsius en zuig het bovenstaande op voordat u de pellet opnieuw suspendeert in 500 microliter PBS. Nogmaals, centrifugeer de cellen, zuig zoveel mogelijk supernatans op zonder de pellet te verstoren en breek, vries de pellet in.

Voor de extractie van genomisch DNA wordt de pellet geresuspendeerd met 50 microliter DNA-extractieoplossing. Homogeniseer het en breng het hele volume over in een PCR-buisje van 0,2 milliliter. Draai de buis en centrifugeer deze kort gedurende een puls van drie seconden.

Plaats de buis in een thermische cycler en verwarm gedurende 15 minuten op 65 graden Celsius, gevolgd door 98 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verdun vervolgens het geëxtraheerde DNA met 90 microliter ultrapuur water, vortex en centrifugeer kort bij 5000G gedurende drie seconden. Verdun de PCR-primer in ultrapuur water tot een uiteindelijke concentratie van 10 micromol.

Bereid het PCR-mengsel voor in een PCR-buisje van 0,2 milliliter. Plaats de PCR-buisjes in de thermische cycler en voer het programma uit met de opgegeven instellingen. Voor polyklonaal bewerkte populaties in een nieuwe tube van 0,2 milliliter.

Meng 17,5 microliter van de PCR-amplicon met twee microliter E-buffer twee voor een eindvolume van 19,5 microliter. Draai de oplossing en centrifugeer kort, of meng voor het screenen van eencellige klonen de PCR-producten van de bewerkte en onbewerkte controlecellen in een één-op-één-verhouding. Voor hetero-duplexvorming plaatst u de buizen in een thermische cycler en voert u het gegeven programma uit.

Voeg na de hetero-duplexvorming 0,5 microliter T seven endonuclease één oplossing toe aan de buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Om de monsters voor te bereiden op gelelektroforese, mengt u vijf microliter van de T7 endonuclease één spijsverteringsproducten of onverteerd PCR-product met vijf microliter water en twee microliter zes xDNA-laadkleurstof, laadt u de monsters en de grootteladder in de gel en laat u de gel gedurende 45 minuten op 80 volt draaien. CRISPR Cas9-gemedieerde genbewerking van de EGFP-locus resulteerde in een scherpe afname van GFP-positieve cellen die op dag zeven na elektroporatie een vermindering van meer dan 90% bereikte.

Op dag drie na elektroporatie was het aantal cellen gehalveerd als gevolg van door elektroporatie veroorzaakte stress, maar volledig hersteld op dag zeven in volledig RPMI-medium. T7 Endonuclease one say en Agarose's gelelektroforese toonden het verlies aan van ongeveer 75 basenpaarfragmenten in bewerkte cellen, wat de CRISPR-bewerking van de EGFP-doellocatie bevestigt.