Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Kraakbeenherstel bij chronische gewrichtsaandoeningen vereist geavanceerde celgebaseerde therapieën om beschadigde weefsels efficiënt te regenereren. Dit protocol biedt een stapsgewijze methode voor het differentiëren van geïnduceerde pluripotente stamcellen in op chondrocyten gebaseerde sferoïden, ter ondersteuning van weefselmanipulatie en celtherapietoepassingen. Kraakbeenherstel bij chronische gewrichtsaandoeningen vereist geavanceerde celgebaseerde therapieën om beschadigd weefsel voldoende te regenereren.

Dit protocol biedt een stapsgewijze methode voor het differentiëren van geïnduceerde pluripotente stamcellen in op chondrocyten gebaseerde sferoïden, ter ondersteuning van weefselmanipulatie en celtherapietoepassingen. De belangrijkste uitdagingen zijn het minimaliseren van type 1 collageenexpressie in iPSC-afgeleide cellen om fibreus kraakbeen te voorkomen, het creëren van voorwaarden voor volwassen highline kraakbeenvorming, het verbeteren van 3D-kweekmethoden voor sferoïde stabiliteit en het ontwikkelen van schaalbare benaderingen voor het produceren van klinische hoeveelheden cellulair materiaal. Het protocol biedt een voordeel door iPSC's te gebruiken als alternatieve bron van chondrocyten, waardoor schaalbare productie mogelijk is zonder invasieve procedures.

Het zorgt voor een beter onderhoud van het chondrocytenfenotype door middel van 3D-kweek en bootst de natuurlijke ontwikkeling van kraakbeen na, wat resulteert in cellen die sterk lijken op natuurlijke chondrocyten met een hoge expressie van kraakbeenspecifieke markers. Ontwikkel effectieve methoden om de volwassenheid en functionaliteit van iPSC-afgeleide chondrocyten te verbeteren, zorg voor stabiliteit op lange termijn in vivo, creëer gefibroseerde driedimensionale kweekmaterialen en ontwikkel schaalbare productie van cellulair materiaal voor klinische toepassing. Steriliseer om te beginnen de schaar in een autoclaaf die is ingesteld op 121 graden Celsius met 15 pond per vierkante inch gedurende 30 minuten.

Nadat de schaar is droog, snijdt u de centrifugebuisjes in ringen van zeven tot acht millimeter hoog. Maal nu onbehandelde of microbiologische petrischaaltjes met een lage hechting in kleine stukjes met behulp van een geschikt breekgereedschap. Los 's nachts ongeveer één gram plastic deeltjes op in 10 milliliter chloroform in een zuurkast.

Controleer de viscositeit van de vloeibare plastic oplossing om er zeker van te zijn dat deze geschikt is voor pipetteren. Als de oplossing te dun is, voeg dan één tot drie gram extra plastic deeltjes toe. Als het te dik wordt, verdun het dan met ongeveer vijf milliliter chloroform.

Plaats een plastic ring van een autoclaaf in het midden van een petrischaal van 60 millimeter. Breng vervolgens vloeibaar plastic aan in de ring om een plastic knop te vormen. Laat de vaat twee tot drie uur onafgedekt drogen in een laminaire afzuigkap.

Stel de vaat na het drogen 20 tot 30 minuten bloot aan ultraviolette straling. Verkrijg om te beginnen de gemodificeerde petrischaaltjes met plastic knoppen. Was twee dagen na de kraakbeenoogst kraakbeenstukjes in Hank's oplossing met behulp van petrischaaltjes van 60 millimeter.

Snijd vervolgens het kraakbeen in fragmenten met een diameter van ongeveer één tot twee millimeter met behulp van een autoclaafschaar. Breng kraakbeenstukjes over in een buis van 15 milliliter en verteer ze in een 0,01% collagenase type twee-oplossing in DMEM gedurende acht tot 12 uur in een orbitale shaker-incubator. Voeg na de vertering de kraakbeenfragmenten toe met DMEM en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 300 G.

Nadat u de wasoplossing hebt weggegooid, suspendeert u de fragmenten opnieuw in een chondrocytenkweekmedium en zaait u ze op een zelfklevende T25-kolf die is voorgecoat met 0,1% gelatineoplossing en incubeert. Kweek vervolgens geïnduceerde pluripotente stamcellen in platen met zes putjes die vooraf zijn gecoat met een matrix die extracellulaire eiwitten bevat. Om differentiatie naar de chondrocytaire lijn op gang te brengen, kweekt u iPSC's in medium A gedurende de eerste twee dagen.

Vervang op dag drie medium A door een oplossing die CHIR-99021 en rhokinaseremmer uitsluit, terwijl alle andere componenten ongewijzigd blijven. Breng op dag 10 chondrocytachtige cellen over naar medium B dat is geformuleerd om chondrogenese te vergemakkelijken en smelt vervolgens 1,5% argarose in een magnetron gedurende ongeveer 60 tot 90 seconden bij 700 watt. Eenmaal vloeibaar gemaakt, voeg je 75 microliter van de agarose toe aan elk putje van een 96-well celsuspensiecultuurplaat en laat je deze bij kamertemperatuur uitharden.

Voeg vervolgens 150 microliter DMEM toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende ten minste 12 uur in een kooldioxide-incubator. Observeer op dag 12 de fenotypische veranderingen die verband houden met androgenese om door te gaan met sferoïde initiatie. Maak cellen met 80% samenvloeiing los van de plaat met behulp van een 0,05% trypsine-oplossing.

Na het toevoegen van gelijke hoeveelheden DMEM met 10%FBS, brengt u de cellen over in een buis van 15 milliliter en centrifugeert u gedurende vijf minuten bij 200 G. Resuspendeer de cellen in één milliliter medium B en breng ze over naar een celkweekkolf van 75 vierkante centimeter die is voorgecoat met 0,1% gelatineoplossing. Zodra de cellen 80% confluentie als een monolaag hebben bereikt, maakt u ze weer los met trypsine en resuspendeert u ze in medium B. Doseer de cellen nu in een plaat met 96 putjes bedekt met 1,5% agarose met een dichtheid van 100.000 cellen per putje, samen met 150 microliter medium B. Incubeer de cellen minimaal één dag en maximaal drie dagen totdat sferoïden zijn gevormd.

Breng vervolgens de sferoïden uit de putjes met behulp van een pipetpunt van één milliliter met een bijgesneden uiteinde over naar een buis van 15 milliliter. Laat de sferoïden twee tot drie minuten bezinken en verwijder de supernatant. Dompel de sferoïden nu onder in vers ontdooide, onverdunde basaalmembraanmatrixoplossing die is getemperd op vier graden Celsius.

Centrifugeer de buis na 30 minuten gedurende één minuut op 100 G om de sferoïden op te vangen. Breng ten slotte de sferoïden over in de voorbereide mini-bioreactoren en voeg zes milliliter medium B toe. Plaats de mini-bioreactor in een kooldioxide-incubator. Na 19 dagen differentiatie bracht 99% van de cellen chondrogene markers aggrecan, collageen type één, collageen type twee en SOX9 tot expressie.

Chondrosferen van hoge kwaliteit werden geïdentificeerd als chondrosferen met ten minste 90 tot 95% expressie van chondrocytaire genmarkers, beoordeeld door middel van genexpressieanalyse op dag 30 van differentiatie. Rijpe sferoïden vertoonden een consistente morfogenese en groeiden na twee maanden tot een typische diameter van één tot twee millimeter, waarbij grotere sferoïden centrale zones met holtes of necrose vertoonden.