Een snelle, eenvoudige workflow voor het kwantificeren van externe volwassen Drosophila-structuren

Ons laboratorium is geïnteresseerd in het begrijpen hoe intracellulaire pH-dynamiek cellulair gedrag moduleert. We zijn geïnteresseerd in gedrag dat bijdraagt aan de progressie van kanker, omdat we weten dat de intracellulaire pH bij de meeste vormen van kanker verhoogd is. We doen veel aan microscopie en ontwikkelen protocollen om gegevens van deze beelden te kwantificeren.

We leren meer over cellulaire routes en processen die worden gereguleerd door pH. De meeste kankercellijnen hebben een hogere intracellulaire pH en veel vertonen verhoogde niveaus van autofagie, maar we wisten niet dat dit verband hield. We hebben onlangs aangetoond dat een hogere intracellulaire pH in genetisch normale cellen voldoende is om autofagie te verhogen.

Ons lab is een van de weinige laboratoria die bestuderen hoe intracellulaire pH of PHI het celgedrag in een heel diermodel reguleert. We hebben ontdekt dat verhoogde PHI een verhoogde celproliferatie, invasieve celmigratie en weefseldesorganisatie bevordert. Onlangs ontdekten we dat een hogere PHI autofagie bevordert, wat een vorm van cellulair kannibalisme is.

We pakken de kloof aan die is ontstaan door de hoge kosten en complexiteit van het voorbereiden van monsters voor SEM, waardoor de toegankelijkheid voor veel laboratoria wordt beperkt. In de staat San Jose hebben we niet de middelen voor SEM. Daarom hebben we een toegankelijker en betaalbaarder protocol ontwikkeld waarmee we de beelden met hoge resolutie kunnen vastleggen zonder dat we dure apparatuur nodig hebben.

Dit protocol combineert traditionele technieken die in de entomologie worden gebruikt en biedt een kosteneffectief en gebruiksvriendelijk alternatief voor scanning elektronenmicroscopie. Het kan gemakkelijk worden aangepast om beelden met een hoge resolutie vast te leggen van verschillende delen van de vlieg of verschillende exemplaren. Selecteer om te beginnen de gewenste drosophila-stam en plaats deze in een injectieflacon met vliegenvoer.

Incubeer de injectieflacon bij 25 graden Celsius totdat de vliegen zijn gegroeid en de volwassenen dichtbij zijn. Verdoof vervolgens de volwassen vliegen met kooldioxide en plaats ze op een kooldioxidekussen. Bereid een verenvliegsorteerder voor door een ganzenveer bij te knippen zodat deze past op het taps toelopende uiteinde van een serologische pipet van één milliliter.

Sorteer de vliegen met een veer en selecteer de individuen met rechte vleugels. Voeg vervolgens een milliliter 70%ethanol toe aan een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Breng de geselecteerde vliegen over in de buis en plaats de buis op ijs.

Met behulp van een gespecialiseerde puntpons. Snijd kleine driehoekige punten uit archiefkarton van 65 pond. Gebruik vervolgens Dumont pincet nummer vijf om de punt van elk punt in een hoek van 90 graden te buigen.

Verwijder de vliegen uit de micro centrifugebuis met behulp van Dumont nummer vijf pincet met fijne punt. Dep de vliegen voorzichtig met pluisvrije tissue om overtollige ethanol te verwijderen. Leg elke vlieg op zijn linkerzij op een indexkaart onder een ontleedmicroscoop.

Meng met een transferpipet één tot twee druppels huidenlijm met één tot twee druppels gedeïoniseerd water op een indexkaart. Pak met een tang een voorbereide kaartpunt aan het brede uiteinde en dep de gebogen punt in het lijmwatermengsel om een kleine hoeveelheid lijm aan te brengen. Breng de gebogen punt van de kaartpunt aan op de voorste kant van de rechterbuik van de vlieg rond buiksegmenten twee en drie.

Voordat de lijm droogt, stelt u de vlieg zo af dat de voorste achteras loodrecht staat op de gebogen punt van de kaartpunt. Steek een montagepen nummer drie in het brede uiteinde van de kaartpunt en bevestig deze aan een insectenspeldblok. Label elke pin of rij pinnen met het bijbehorende genotype.

Om foto's met een hoge resolutie van op een punt gemonteerde drosophila-ogen te verkrijgen, schakelt u het stapelbeeldvormingssysteem in. Stel vervolgens een DSLR-camerabody in met een telelens van 70 tot 200 millimeter die via een lensadapter van 77 millimeter is bevestigd aan een 20x Apo-microscoopobjectief. Zorg ervoor dat het preparaat wordt verlicht met een flits door een diffuser.

Bedien de Z-positionering van de camera met behulp van een StackShot-controller en macrorail. Plaats de op het punt gemonteerde vlieg op de universele podiumgimbal met het oog naar de lens gericht. Pas de positie van het hoofd aan en gebruik voorzichtig een pincet voor een optimale uitlijning.

Bevestig de camera aan een laptop en pas de acquisitie-instellingen aan. Stel de vergroting in op 20x, sluitertijd, 1/200 seconde, diafragma f/2.8 en ISO 400. Stel vervolgens de locatie in voor het opslaan van de resulterende afbeeldingsstapel in de gewenste bestandsmap.

Pas nu de instellingen van de focusstapel aan op de StackShot-besturingseenheid in de automatische afstandsmodus. Stel de stapgrootte in op vijf micrometer en bereken het aantal stappen door de start- en stopposities van de focusstapel in te stellen. Bekijk het preparaat in de live view-modus met de camera in de automatische opnamemodus.

Verplaats de rail zodat het dichtstbijzijnde deel van het preparaat scherp is. Ga vervolgens naar het meest interessante kenmerk en pas de focus aan. Zet de camera terug naar de handmatige opnamemodus en start de beeldacquisitie vanaf de StackShot-besturingseenheid.

Open na het maken van de afbeelding de verkregen afbeeldingsbestanden in de software voor het stapelen van focus waarnaar wordt verwezen. Selecteer Stapelen, vervolgens alles uitlijnen en stapelen of Pmax om een gestapelde afbeelding te genereren. Klik vervolgens op Bestand en sla de uitvoerafbeelding op om de uiteindelijke gestapelde afbeelding op te slaan als een tif-bestand.

Nadat u op een pin gemonteerde drosophila-ogen hebt afgebeeld, selecteert u de gestapelde afbeelding voor analyse waarbij het oog is gecentreerd en uitgelijnd met voldoende verlichting en minimale perifere vervaging. Open de afbeelding van de schaalbalk van 500 micrometer in Fiji-software. Meet de lengte van de schaalbalk met behulp van het gereedschap voor een rechte lijn.

Klik op Analyseren en meten om de pixelafstand vast te leggen, die overeenkomt met 500 micrometer. Bereken vervolgens pixels per micron en gebruik dit om pixelmetingen om te zetten in micrometermetingen. Open het gestapelde afbeeldingsbestand in Fiji.

Selecteer vergrootglas op de werkbalk om het scherpstelgebied te vergroten. Vul het scherm met het oog en de omliggende nagelriem van het hoofd. Selecteer vervolgens in de werkbalk het selectiegereedschap uit de vrije hand en schets het netvliesgebied volgens de buitenste rij ommatidia.

Als u een deel van de selectie wilt verwijderen, houdt u de Option-toets ingedrukt en selecteert u de pixels die u wilt verwijderen. Als u de selectie wilt uitbreiden, houdt u de Option- en Shift-knoppen ingedrukt en selecteert u de pixels die u wilt toevoegen. Als u de oppervlakte wilt berekenen, selecteert u Analyseren en meten.

Een nieuw venster toont de oppervlakte-, gemiddelde, minimum- en maximumparameters. Kopieer en plak de gegevens in een spreadsheet voor documentatie en conversie van pixels naar micrometermetingen. Overexpressie van DNhe2 in GMR-DNhe2-vliegen resulteerde in significant kleinere volwassen ogen in vergelijking met volwassen vliegen van het wildtype.

GMR-DNhe2 vliegen vertoonden een reductie van 41% in het gebied rond de ogen in vergelijking met wildtype vliegen en een reductie van 48% in vergelijking met GMRGAL4 heterozygote vliegen. De ooggrootte werd hersteld in GMR-DNhe2-vliegen die heterozygoot zijn voor Atg1-allel 3, waardoor het van 74,28 vierkante micrometer naar 129,9 vierkante micrometer kwam.