Organotypische weefselmodelsystemen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro

Tandheelkundige plat-biofilms bestaan uit honderden micro-organismen die ontstekingen in hun orale epitheel kunnen veroorzaken, wat kan leiden tot ziekten zoals gingivitis. We willen deze interacties beter begrijpen, met behulp van organotypische weefselmodellen. Deze systemen bieden nuttige platformen om alternatieve behandelingsmodaliteiten op een gecontroleerde manier te beoordelen.

Dus de vooruitgang van sequencing-technologieën in de afgelopen jaren transformeert het gebied van infectiebiologie. Deze technologieën stellen ons in staat om interacties tussen gastheerpathogenen echt te onderzoeken, met behulp van meerdere OMICs-technieken door de beoordeling van gastheer- en microbiële handtekeningen op proteomisch, transcriptomisch en metabolomisch niveau. Ons recente onderzoek heeft het belang benadrukt van interkingdom- en polymicrobiële interacties bij biofilmgerelateerde infecties.

Door het gebruik van in-vitro modelsystemen zijn we in staat geweest om gastheerbiofilminteracties te onderzoeken, nieuwe anti-biofilmtherapieën te testen en microbiële gemeenschappen te profileren, met behulp van innovatieve technologieën zoals RAM en spectroscopie. Toekomstige studies, waarbij gebruik wordt gemaakt van deze organotypische weefselmodellen, zullen gericht zijn op het bereiken van een multi-OMIC-signatuur en profilering van het micro-organisme en gastheerweefsel en de gastheer samen. We hopen complexe interacties tussen de gastheer en specifieke bacteriën en schimmelsoorten te ontdekken en te ontwarren in onze biofilmmodellen.

Verwijder om te beginnen de bevroren stengels van poreuze kralen die streptokokkensoorten bevatten van 80 graden Celsius. Breng streptokokkensoorten nieuw leven in op de basisplaten van Columbia-bloedvijzels, die 5% steriel gedefibreerd paardenbloed bevatten. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Breng de volgende dag drie tot vier kolonies van het bord over op 10 milliliter trypton-sojabouillonmedium. Kweek de bouillon 16 tot 18 uur op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Na incubatie centrifugeert u de celsuspensies bij 3.000 G gedurende vijf minuten bij 20 graden Celsius.

Was de celkorrels met 10 milliliter steriel PBS. Resuspendeer de pellets in 10 milliliter PBS en standaardiseer elke streptokokkensoort suspensie, afzonderlijk, met behulp van een spectrofotometer die is ingesteld op 550 nanometer. Verdun na standaardisatie elke streptokokkensuspensie, één tot 10, om een concentratie van één keer 10 te bereiken tot de macht van zeven cellen per milliliter in een één-op-één mix van Todd Hewitt-bouillon en Roswell Park Memorial Institute-medium.

Pipetteer 500 microliter verdunde celsuspensies op een microtiterplaat met 24 putjes, die een hydroxyapatietschijf van 13 millimeter bevat. Incubeer de cultuur gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om biofilmvorming mogelijk te maken. Op een vergelijkbare manier, kweek voor anaërobe micro-organismen op een kieskeurige anaërobe vijzelbasis, die 5% steriel gedefibreerd paardenbloed bevat.

Standaardiseer elk anaëroob micro-organisme tot een specifieke absorptie en verdun ze in een één-op-één mix van Todd Hewitt-bouillon en Roswell Park Memorial Institute-medium. Na de rijping van de streptokokkenbiofilm verwijdert u voorzichtig niet-aangehechte cellen en gebruikte media uit de putjes. Voeg 500 microliter gestandaardiseerde één keer 10 toe aan de kracht van zeven cellen per milliliter suspensies van vier anaërobe micro-organismen in elk putje.

Incubeer de biofilms gedurende 24 uur onder anaërobe omstandigheden bij 37 graden Celsius. Verwijder de volgende dag niet-aangehechte cellen en gebruikte media uit de putjes. Voeg 500 microliter steriele één-op-één mix van Todd Hewitt-bouillon en Roswell Park Memorial Institute-medium toe.

Kweek de biofilms gedurende 24 uur onder anaërobe omstandigheden. Was de biofilms op dag zeven twee keer met 500 microliter steriel PBS voor co-cultuur. Om te beginnen, pakt u het menselijke orale epitheel of HOE-weefsel en -media uit en brengt u het over naar een veiligheidskast van klasse twee.

Voeg een milliliter van de onderhoudsmedia die bij het weefsel worden geleverd toe aan elk putje van een plaat met 12 putjes. Verwijder met een steriel pincet de inzetstukken van polycarbonaat met het HOE-weefsel van de voedingsvijzel en de verzendplaat met 24 putjes. Breng het weefsel over naar de voorbereide plaat met 12 putjes.

Incubeer de weefselmodellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om ze te laten acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden. Ondertussen, om de biofilms van de hydroxyapatietschijven te verwijderen, gebruikt u een naald en een pincet van 19 gauge om de schijven van de bodem van de plaat met 24 putjes te tillen. Breng de schijven over in een bijou, die één milliliter steriele DPBS bevat.

Sonificeer de schijven gedurende 10 minuten bij 35 kilohertz in een sonicatiewaterbad. Gebruik na acclimatisatie een pincet om de weefselinzetstukken van de plaat met 12 putjes te verwijderen. Pipetteer 100 microliter van de biofilmsonicaatsuspensie rechtstreeks op de weefselmodellen.

Breng de inzetstukken over naar een andere plaat met 12 putjes met een milliliter verse onderhoudsmedia. Incubeer de weefselmodellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Bereid voor weefselverwerking 350 microliter RLT-lysisbuffer voor, die 1% bundel mercaptoethanol bevat in een O-ringbuis met schroefdop van twee milliliter.

Voeg ongeveer 100 microliter 0,5 millimeter acid washed glasparels toe aan de tube. Verwijder met een pincet de inzetstukken met het weefsel van de media en gooi de resterende microbiële suspensie van de inlegger weg. Houd het inzetstuk omgekeerd op ooghoogte en gebruik vervolgens een naald van 19 gauge om het weefsel en het membraan voorzichtig vanaf de onderkant van het inzetstuk te snijden.

Breng het weefsel en het membraan over in de voorbereide RLT-buffer. Homogeniseer het weefsel gedurende 30 seconden met behulp van een benchtop bead beader homogenisator. Extraheer RNA uit het resulterende lysaat, volgens de instructies van de fabrikant voor RNA-extractiekit.

Verzamel de resterende gebruikte weefselmedia voor proteomische analyses, met behulp van methoden met een lage en hoge doorvoer. De genexpressie van inflammatoire biomarkers in het HOE-weefsel was significant opgereguleerd na blootstelling aan biofilmsoniaat, vergeleken met de niet-gestimuleerde controlegroep. De grootste vouwveranderingen werden waargenomen voor CCL2, CXCL1 en CSF3.

De expressie van IL8-mRNA in HOE-weefsel was 8,67 keer verhoogd na stimulatie met biofilmsonicate, vergeleken met gecontroleerd weefsel. Het IL8-eiwitgehalte in de gebruikte media werd verhoogd van 1,005 nanogram per milliliter in controleweefsel tot 4,245 nanogram per milliliter in door biofilm sonicaat gestimuleerd weefsel.