Optimalisatie van in vitro transcriptiereactie voor mRNA-productie met behulp van chromatografische at-line monitoring

We hebben een snelle chromatografische methode ontwikkeld die IVT-reactiecomponenten scheidt en kan worden gebruikt om NTP-consumptie en mRNA-productie te monitoren. Met deze methode kunnen we de IVT-reactie optimaliseren, de mRNA-opbrengst maximaliseren en tegelijkertijd de vorming van procesonzuiverheden en de kosten van de reactie minimaliseren. Onze methodologie was baanbrekend op het gebied van mRNA en liet zien hoe het koppelen van analytische gegevens van IVT-reacties kan leiden tot hogere opbrengsten en lagere kosten.

Het veld onderzoekt nu andere inline procesanalytische instrumenten, zoals Raman-spectroscopie, maar chromatografie behoudt nog steeds een centrale plaats vanwege het oplossend vermogen en de hoge snelheid. We hebben laten zien hoe analytische tools met hoge doorvoer kunnen worden vastgelegd met het ontwerp van experimentsoftware om een uitgebreide optimalisatie van de IVT-reactie te maken. Dit leidde tot de hoogste gerapporteerde opbrengst van IVT-reactie van 25 gram per liter.

Onze methode maakt het mogelijk om zowel mRNA- als NTP-concentraties tegelijkertijd te monitoren met korte uitleestijden, en is daarom geschikt voor bijna realtime IVT-monitoring. Het mRNA-veld evolueert nu in de richting van een voortdurende productie van mRNA, en we ontwikkelen natuurlijk tools van de volgende generatie om deze overgang te ondersteunen. Om te beginnen ontdooit en verwarmt u alle reagentia, behalve enzymen, gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius in een thermoblok dat is ingesteld op 300 omwentelingen per minuut.

Markeer elk buisje met een aangewezen in vitro transcriptie- of IVT-nummer en tijdstip. Terwijl de reagentia ontdooien, pipetteert u twee microliter EDTA van 100 millimolair in steriele buisjes van 0,5 milliliter. Haal nu de enzymen uit de vriezer en bewaar ze tijdelijk in een koelbox.

Bereid 50 tot 100 microliter van het reactiemengsel voor met de juiste hoeveelheden IVT-reagentia. Voeg T7 RNA-polymerase toe als het laatste reagens wanneer alle IVT-reagentia zijn gemengd. Verwijder onmiddellijk twee microliter van het IVT-mengsel en pipetteer het in eerder voorbereide buisjes van 0,5 milliliter met twee microliter EDTA.

Plaats de reactiebuisjes met IVT-mengsels in het thermoblok en incubeer ze bij 37 graden Celsius. Verwijder op elk gewenst tijdstip twee microliter van het IVT-monster uit het reactiemengsel en pipetteer in buisjes met EDTA. Nadat chromatografische analyse de volledige uitputting van NTP's bevestigt, doof bulk IVT-reacties met EDTA af tot een uiteindelijke concentratie van 50 millimolair.

Meng voor de Fed-Batch IVT-reactie voorraden van elk NTP en magnesiumchloride. Wanneer de NTP-concentratie na het instellen van de reactie onder de 10% daalt, voegt u een geschikt volume van het voer toe aan de bulk IVT-reactie. Zodra de gewenste mRNA-productie is bereikt, inactiveert u de hele reactie met EDTA tot een uiteindelijke concentratie van 50 millimolair.

Breng voor kolomconditionering een analytische kolom van 0,1 milliliter in evenwicht bij kamertemperatuur gedurende 12 uur voorafgaand aan de analyse. Bevestig de kolom aan het chromatografische systeem in de richting die op de kolombehuizing wordt aangegeven. Spoel de kolom vervolgens door met 50 kolomvolumes dubbel gedestilleerd water, gevolgd door 50 kolomvolumes MPA met een debiet van één milliliter per minuut.

Voer vervolgens ten minste drie blanco monsters uit en injecteer alleen MPA vóór analyse om de basislijn vast te stellen. Ga nu verder met het analyseren van het testmonster voor de geschiktheid van het systeem en de monsters van de kalibratiecurve. Combineer voor de geschiktheidstest van het systeem de afdekreagens NTP's, het plasmide-DNA-sjabloon en het mRNA.

Maak nu de kalibratiestandaard met behulp van het verdunde gezuiverde mRNA-monster met een bekende concentratie met mobiele fase A. Maak indien nodig standaarden met uiteindelijke NTP-concentraties van 0,5, twee, vijf, 10, 15 en 20 micromolair voor het genereren van de kalibratiecurve voor alle NTP's. Bepaal de minimale verdunning die nodig is voor IVT-monsters met behulp van de formule. Alvorens te verdunnen voor chromatografische analyse, vortex en spint u het gedoofde IVT-monster naar beneden.

Pipetteer MPA en natriumchloride in een conische glazen injectieflacon en voeg vervolgens het gedoofde IVT-monster toe. Vortex het voorbereide monster en laad het in de autosampler, ingesteld op vier graden Celsius. Injecteer 25 microliter van het verdunde monster op de analytische kolom en meet de extinctie bij 260 en 280 nanometer voor elk IVT-monster.

Nadat de analyse van alle IVT-monsters is voltooid, injecteert u de systeemgeschiktheidsteststandaard opnieuw om de stabiliteit van het systeem te bevestigen. Snelle at-line analyse maakt het mogelijk om de productie van mRNA in de loop van de tijd te volgen. In dit experiment vergeleken we de invloed van de samenstelling van de IVT-buffer op de IVT-kinetiek.

IVT uitgevoerd met buffer A resulteerde in de hoogste snelheid van mRNA-productie, gevolgd door buffer B en buffer C.IVT-reactie kan ook worden uitgevoerd als een Fed-Batch. Het monitoren van het verbruik van NTP's maakt het mogelijk de concentratie aan te passen door NTP's en magnesiumchloride aan de reactie te voeren. Omdat voertoevoegingen de IVT-reactie verdunnen, daalt de mRNA-concentratie in IVT bij elke voereditie.