Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

De reikwijdte van het onderzoek is de pathogenese van leukemie. We streven ernaar genen te identificeren die cruciaal zijn voor abnormale HSPC-proliferatie door CRISPR/Cas9 te combineren met CCK-8-testen, waardoor hun rol in tumorogenese en het potentieel als medicijndoelen worden onthuld.

Op CRISPR/Cas-9 gebaseerde genbewerking biedt een eenvoudige en efficiënte aanpak voor het bereiken van genknock-out in uw eukaryote cellen. De huidige experimentele uitdaging is om de efficiëntie van CRISPR/Cas-9 knock-out verder te verhogen.

Ons protocol maakt gebruik van Cas-9-muizen om beenmergcellen te voorzien van consultatieve Cas-9-expressie, waardoor virale afgifte van SGI's in de cellen wordt verbeterd, waardoor de experimentele efficiëntie aanzienlijk wordt verbeterd.

[Presentator] Verkrijg om te beginnen het dijbeen en het scheenbeen van de geëuthanaseerde experimentele muis. Breng het dijbeen en het scheenbeen onmiddellijk na verwijdering over naar een laminaire stromingskap om de steriliteit te behouden. Spoel met een steriele spuit van één milliliter de beenmergholte door met PBS met 2% FBS om beenmergcellen te verzamelen. Pipetteer de beenmergcellen 30 tot 50 keer op en neer om ze in afzonderlijke cellen te verspreiden. Breng het celmengsel over in een buis van 50 milliliter en draai om goed te mengen. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan 40 microliter erytrocytenlysisbuffer en plaats het vijf minuten op ijs om de erytrocyten te lyseren. Voeg vervolgens 50 microliter Trypan blauwe oplossing toe. Meng goed en tel levensvatbare cellen. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 800 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en aspireer de supernatant op. Suspentie vervolgens de cellen opnieuw in een concentratie van één tot twee keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter in het beenmerg, het pre-stimulatiemedium. En zaai 10 milliliter van de suspensie in een schaal van 10 centimeter. Incubeer het gerecht 24 uur bij 37 graden Celsius. Om de voorgestimuleerde cellen de volgende dag op te vangen, voegt u vijf tot 10 milliliter PBS met 2% FBS toe en spoelt u de plaat krachtig af. Doe de cellen in een verse tube en voeg Trypan blue toe aan de cellen. Tel levensvatbare cellen in het mengsel. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij 800 G bij kamertemperatuur. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, suspendeert u de cellen opnieuw in een vers bereide spinfectieoplossing in een concentratie van ongeveer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter. Zaai vier milliliter van de suspensie in elk putje van een plaat met zes putjes. Sluit de plaat af met parafilm en centrifugeer deze gedurende 90 minuten bij 1.500 G bij 32 graden Celsius. Breng de cellen na het centrifugeren voorzichtig opnieuw in suspensie met een pipet zonder het medium te veranderen. Incubeer de plaat gedurende vier tot zes uur. Voor de eerste transfectie, aspireer ongeveer drie milliliters van supernatans middel van elke put in een buis, en voeg een gelijk volume van het middel van de beenmergprestimulatie toe. Als cellen per ongeluk worden opgezogen, herhaalt u de stappen voor centrifugeren en resuspensie zoals eerder beschreven. Voor de secundaire transfectie, verwijdert u de volgende dag twee tot drie milliliters medium uit elk putje en voegt u een gelijk volume vers ontdooide retrovirale voorraadoplossing samen met de juiste hoeveelheden hepas en polygreen toe. Centrifugeer de plaat gedurende 90 minuten bij 1.500 G bij 37 graden Celsius. Na het centrifugeren worden de cellen voorzichtig opnieuw in suspensie gebracht en wordt de incubatie vier tot zes uur voortgezet. Vervang nu het medium zoals eerder beschreven en incubeer gedurende 24 uur. Was de plaat met PBS met 2% FBS en verzamel de cellen. Filtreer de cellen door een zeef van 70 micrometer voordat u de levensvatbare cellen telt met Trypan blue. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten bij 800 G bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in DMEM die 10% FBS en muizeninterleukine-3, interleukine-6 en stamcelfactor bevatten. Centrifugeer ongeveer 0,5 tot 1x10 tot de macht van zes cellen bij 800 G gedurende vijf minuten en gooi het bovenstaande weg. Bewaar de celpellet bij -80 graden Celsius voor genomische DNA-extractie. Voeg nu 1x10 toe aan de kracht van vier cellen per putje in een plaat met 96 putjes, waardoor je zes replicatieputjes per groep maakt. Voeg vervolgens 100 microliter steriel PBS toe aan de omliggende putjes en incubeer tot verschillende tijdstippen van 0, 24, 48 en 72 uur. Zuig het medium op elk tijdstip op en voeg 110 microliter medium met 1/10e volume CCK-8-oplossing toe aan de putjes. Incubeer het mengsel gedurende een uur. Meet ten slotte de extinctie bij 450 nanometer met behulp van een microplaatspectrofotometer. Trp53 knock-out verhoogde de proliferatieve capaciteit van muis-, hematopoëtische stam- en voorlopercellen aanzienlijk in vergelijking met controles na 24, 48 en 72 uur, zoals gemeten met de CCK-8-test. De bewerkingsefficiëntie van de Trp53 werd geschat op 7,3% met behulp van TIDE-analyse. En sequencing van de volgende generatie onthulde mutaties die op verschillende posities in het gen voorkwamen.