Patch-clamp-technieken voor analyse van enkelvoudige endolysosomale blaasjes
April 4th, 2025
Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire blaasjes met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp-systeem. We illustreren de methode waarbij endolysosomen worden vergroot en deze blaasjes handmatig worden geïsoleerd. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.
Endolysosomale compartimenten zijn de kleinste organellen in cellen. Traditionele elektrofysiologische technieken zijn niet in staat om hun spannings- en stroomveranderingen direct te meten. De endolysosoom patch-clamp techniek maakt directe opnames mogelijk, waardoor we eerder in de ionenkanalen kunnen studeren.
De grote experimentele uitdaging is dat niet alle verbindingen lysosomen effectief vergroten. Het identificeren van geschikte cellen is moeilijk, en zelfs met ideale lysosomen is een succesvolle opname van ionkanalen niet gegarandeerd. We ontwikkelden de endolysosoom-patch klemtechniek om directe elektrofysiologische opnames van endolysosomale membranen mogelijk te maken.
Deze doorbraak stelde ons in staat om ionkanalen, zoals TRPML's en de TPC's, te karakteriseren en hun rol in de afweer van pathogenen, neurondegeneratie en stofwisselingsstoornissen te onthullen. Onze methode maakt directe opnames van lysosomale ionkanaalopnames mogelijk, waardoor de beperkingen van de patch-klemgrootte van de hele cel worden overwonnen en de selectie van blaasjes wordt verbeterd terwijl op fluorescentie gebaseerde technieken worden geïntegreerd. Installeer om te beginnen de capillaire buis in de polaire.
Druk op de groene trekknop op het toetsenbord. Draai de clampknop los en verwijder de getrokken pipetten van de polaire. Plaats vervolgens de pipetten met getrokken pleister in de Microforge-houder.
Inspecteer de pipetpunten met behulp van een 35x objectieflens, gecombineerd met een 15x oculair voor een totale vergroting van 525x. Gebruik de micromanipulator om de patchpipetten dicht bij het filament te brengen. Zet de temperatuurknop op 80.
Zodra de kachel is ingeschakeld, houdt u de voetschakelaar één tot twee seconden ingedrukt om een korte warmtepuls toe te passen. Plaats de gepolijste pipetten na het polijsten in een afgesloten doos om stofverontreiniging te voorkomen. Voeg een milliliter van de badoplossing toe aan de kamer.
Verwijder een dekglaasje met behandelde HEK 293-cellen van de plaat met 24 putjes. Breng het dekglaasje over naar de microscoopkamer. Gebruik een zelfgemaakte plastic vulnaald om de isolatiepipet te vullen met pipetoplossing.
Installeer de gevulde pipet aan de voorkant van de patch-clamp-opstelling. Beweeg onder een microscoop met een 40x objectief en 10x oculair de isolatiepipet in de buurt van voldoende vergrote endosomen of lysosomen. Laat de isolatiepipet met behulp van de micromanipulator zakken totdat deze de rand van het plasmamembraan raakt.
Beweeg de pipet snel om een klein stukje van het membraan af te scheuren. Druk met dezelfde pipet op de cel vanaf de andere kant om endosomen/lysosomen op ongeveer twee micrometer van de cel uit te knijpen. Vul een vers gepolijste patchpipet met de juiste pipetoplossing.
Installeer de pipet aan de voorkant van de versterker. Oefen een positieve druk van 20 tot 50 millibar uit op de pipet en onderhoud deze door de klep te vergrendelen. Beweeg vervolgens de pipetpunt in de badoplossing en plaats deze in het midden van het gezichtsveld.
Pas herhaalde stroompulsen toe om de pipetweerstand, afdichtingsweerstand en serieweerstand te bepalen. Bewaak de grootte van de pipetpunt, de vorming van de afdichting en de vaststelling van de gehele endolysosomale configuratie. Beweeg de pipet snel dicht bij de bovenkant van het doelblaasje.
Observeer het blaasje dat beweegt of rolt als gevolg van de vloeistofstroom uit de pipet. Stel de offset voltage van de pipet in op nul millivolt. Laat onmiddellijk de positieve druk los om het blaasje naar de pipet te trekken en binnen een seconde een gigaseal te vormen.
Gebruik voor het opnemen van hele blaasjes een korte puls met hoge spanning van twee tot vijf milliseconden om het membraan op het contactpunt tussen de pipet en het organel te verstoren. Stel de spanning in van 500 tot 1000 millivolt. Om stroom te registreren, voert u endolysosomale spanningsklemexperimenten uit met behulp van een breed scala aan ingangsspanningen om de membraaneigenschappen te beoordelen.
Tijdens de vorming van gigasealers nam de stroomrespons snel af, wat wijst op de succesvolle totstandbrenging van de lysosoomaangehechte modus. Herhaalde toepassing van continue ingangsspanning registreerde stromen over het endolysosomale membraan, waarbij basale, agonist-geactiveerde en lekstromen werden weergegeven.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire vesikels met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp systeem. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Endolysosomaal compartimenten zijn de kleinste organellen in cellen.
- Traditionele elektrofysiologische technieken kunnen hun spannings- en stroomveranderingen niet direct meten.
- De endolysosome patch-clamp techniek maakt directe opnames mogelijk.
- Het identificeren van geschikte cellen voor de techniek kan een uitdaging zijn.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor directe elektrofysiologische opnames van endolysosomaal membranen.
- Om ionkanalen te bestuderen die eerder ontoegankelijk waren met traditionele methoden.
- Om de uitdagingen bij het vergroten van lysosomen voor effectieve opnames aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Handmatig endolysosomaal patch-clamp systeem.
- Vergroting van endolysosomen voor isolatie.
- Directe meting van ionkanaalactiviteit.
- Identificatie van geschikte celtypen voor de techniek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle implementatie van de endolysosome patch-clamp techniek.
- Demonstratie van directe opnames van endolysosomaal membranen.
- Identificatie van effectieve verbindingen voor lysosome-vergroting.
- Inzichten in het gedrag van ionkanalen in endolysosomaal compartimenten.
Conclusies
- De endolysosome patch-clamp techniek is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van ionkanalen.
- Deze methode overwint beperkingen van traditionele elektrofysiologie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze techniek om cellulaire mechanismen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct electrophysiological analysis of endolysosomal ion channels addresses a critical gap in early drug discovery by enabling functional target validation within disease-relevant intracellular compartments. This technique enhances predictive confidence for ion channel drug targets implicated in neurodegenerative and metabolic disorders, supporting risk-adjusted portfolio decisions. Its integration into discovery workflows accelerates the identification and mechanistic de-risking of novel therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of endolysosomal ion channel function in native vesicle membranes.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of specific channels in disease pathways.
- Facilitates functional validation of targets linked to neurodegeneration and metabolic disorders.
- Improves predictive confidence for advancing ion channel modulators in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative measurement of ion channel activity in isolated vesicles.
- Enables assay standardization and reproducibility through direct current and voltage recordings.
- Supports integration with fluorescence-based techniques for multiplexed readouts.
- Prepares validated systems for downstream compound screening and evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by targeting endolysosomal dysfunction in human cell models.
- Bridges discovery and preclinical validation by enabling direct measurement of therapeutic modulation effects.
- Supports translational biomarker development through quantifiable electrophysiological outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions endolysosomal patch-clamp as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical validation for ion channel targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for endolysosomal ion channels.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative electrophysiological data for assay development.
- Analytics: Provides direct current and voltage measurements to compare channel activity across conditions.
- Translational Research: Connects functional channel analysis to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse ion channel target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes direct vesicle analysis and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for ion channel programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ion channel targets implicated in complex diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in manual patch-clamp electrophysiology and vesicle isolation.
- Demands high-resolution microscopy and precision micro-manipulation instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible data generation.
- May require adaptation for different cell types or disease models based on vesicle size and accessibility.
- Success depends on effective lysosome enlargement and vesicle selection, as supported by the protocol.
