Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

We bestuderen hoe cellen reageren en zich aanpassen aan mechanische stimuli in fysiologische en pathologische context. Hiervoor gebruiken we het rekapparaat om externe krachten, in dit geval een spanning, op cellen uit te oefenen.

We hebben ontdekt hoe cellen en celweefsels reageren op specifieke mechanische stimuli en hoe ze mechanisch reageren op andere biologische signalen.

Ons rekapparaat is zeer veelzijdig in vergelijking met andere, omdat het de mogelijkheid biedt om cellen die zijn gekweekt op polyacrylamidegels van verschillende stijfheden uit te rekken of om compressie-experimenten uit te voeren.

[Verteller] Plaats om te beginnen de PMMA-ringen op een vel wit bankpapier. Ga voorzichtig met een mes langs de rand van de PDMS-gecoate plaat om een zuivere snede over de gehele omtrek te garanderen. Gebruik een pincet om het membraan aan één rand op te tillen en pel het vervolgens voorzichtig met de duim om de helft van het membraan gelijkmatig van de plaat los te maken. Gebruik de vingers om 96% ethanol gelijkmatig over het gehele bovenoppervlak van de PMMA-ring te verdelen. Verwijder het PDMS-membraan voorzichtig van de plaat door het van de eerder opgetilde rand te tillen. Plaats het vervolgens symmetrisch op de met ethanol bedekte PMMA-ring, zodat er geen kreukels ontstaan en uitrekken wordt voorkomen. Neem vervolgens een andere lege PMMA-ring en plaats deze bovenop de montagering. Gebruik metalen clips om ze aan elkaar af te dichten en klem het PDMS-membraan tussen de twee ringen. Plaats de onderste helft van de rekring op de montagesteun. Plaats de PDMS-ring vastgeklemd op de rekring en duw deze stevig naar beneden totdat deze volledig op zijn plaats zit, waarbij u ervoor zorgt dat de pakking correct is geplaatst. Plaats de ronde messing gewichten op het monster. Plaats vervolgens de bovenste helft van de metalen rekring erop en lijn de schroefgaten uit. Plaats alle schroeven en draai ze vast. Snijd de PDMS rond de ring voorzichtig met een mes. Dek het geheel af met een petrischaal om het membraan tegen stof te beschermen. Bereid een verdunning van 250.000 van fluorescerende kralen van 0,2 micrometer in PBS voor met behulp van seriële verdunning. En plaats een druppel van 10 tot 30 microliter van de kralenoplossing in het midden van het PDMS. Laat het drogen bij een temperatuur die niet hoger is dan 40 graden Celsius om verstorende problemen na uitharding te voorkomen. Monteer nu het rekapparaat op de houder van de microscooptafel en bevestig de rekpaal op de microscoop. Breng royaal glijmiddel aan op het ronde gedeelte van de paal. Monteer de voorbereide rekring op de rekpaal en schroef de bovenkap vast om het geheel af te dichten. Sluit vervolgens de achterkant van de vacuümschakelkast aan op de vacuümbron, gevolgd door de voorkant van de kast op de rekpaal. Om rekkalibratie uit te voeren, kiest u een interessegebied met een hoge kraaldichtheid en herkenbare kraalklonten voor de gebruiker. Verkrijg een afbeelding ten rust van het geselecteerde gezichtsveld en sla de positie op. Breng rek aan bij een laag vacuümniveau van min 20 millibar, waardoor beweging in alle richtingen ontstaat. Stel nu opnieuw scherp in het Z-vlak en verplaats het podium in XY-richtingen om hetzelfde interessegebied te lokaliseren en een beeld te verkrijgen in de uitgerekte toestand. Laat vervolgens de spanning los en herhaal de stappen met een hoger vacuümniveau. Sla verkregen afbeeldingen op in een map die is geordend op voorbeeld. Naam, de referentie-afbeelding van de kraal die is verkregen zonder uitrekken als reference_str1 en de afbeeldingen die zijn uitgerekt bij toenemende vacuümniveaus als stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3, enzovoort. Om de spanning te kwantificeren, opent u MATLAB en laadt u de gelstamcode. Nadat u de parameters hebt ingesteld, definieert u de bovenliggende en de mappaden van het experiment en voert u de code uit. Open vervolgens stretched_str1 zoals gevraagd door de code, gevolgd door de reference_str1. Bereken nu de mediane rekmatrix voor elk vacuümniveau. Nadat u dit proces voor ten minste drie monsters hebt herhaald, zet u de mediane rekmatrix uit versus het vacuümniveau om de kalibratiecurve te verkrijgen. Om de PDMS-ring te coaten, steriliseert u deze gedurende 15 minuten onder ultraviolet licht. Spoel onder een bioveiligheidskast de plaat onder de kap af met steriel PBS. Na het opzuigen van alle PBS die zijn gebruikt om de plaat af te spoelen. Breng een druppel van 100 tot 200 microliter van de oplossing aan in het midden van de ring. Teken de omtrek van de druppel met een permanente marker vanaf de onderkant van het PDMS-membraan en incubeer het. Was op de dag van het experiment het adhesie-eiwit met PBS. Nadat u de cellen hebt geprobeerd, gaat u verder met het tellen van de cellen. Zaai een geschikt aantal cellen in een klein volume van ongeveer 20 tot 50 microliter met standaard celmedia om de hechting te bevorderen en incubeer het in een kooldioxide-incubator met vochtigheidsregeling. Voeg na 20 tot 30 minuten voorzichtig 500 microliter media toe aan de cellen en plaats de plaat terug in de broedmachine om verdere celverspreiding mogelijk te maken. Voor een enkele rekontgrendelingscyclus en beeldvorming monteert u de rekring op de microscooptafel, zoals eerder gedemonstreerd. Nadat u een interessante cel hebt gevonden, registreert u de positie ervan en maakt u een afbeelding van de vooraf uitgerekte cel. Pas het gewenste vacuümniveau toe dat overeenkomt met de vereiste substraatbelasting op basis van de kalibratiecurve om de cel uit te rekken. Om de rekcel te vinden, stelt u eerst opnieuw scherp in het Z-vlak. Beweeg vervolgens in de XY-richtingen om de cel in het gezichtsveld te centreren. Neem beelden op gedurende de gewenste duur. Navigeer naar de oorspronkelijke positie van de cel en activeer de acquisitiemodus van de microscoop om ervoor te zorgen dat het vastleggen van beelden onmiddellijk begint bij het opnieuw scherpstellen. Laat de rek los en stel snel handmatig opnieuw scherp in het Z-vlak. Leg beelden vast van de vrijgekomen cel gedurende de vereiste tijd en pas de focus handmatig aan tijdens de acquisitie. Open Fiji voor nabewerking en laad de afbeeldingen die in rust en tijdens belasting zijn verkregen. Gebruik de Fiji-plug-in-sjabloon om een gebied van de cel te selecteren voor uitlijning. Kalibratie zorgde voor reproduceerbaarheid en controle over de uitgeoefende spanning, wat een bijna lineaire relatie tussen vacuüm en rek tot 20% bevestigde. Radiale verplaatsingsanalyse toonde isotropie en homogeniteit van de spanning over het PDMS-membraan aan. Fluorescentiebeeldvorming van fibroblastcellen onder levende celrekking onthulde membraaninvaginaties bij het loslaten van rek, die binnen drie tot vijf minuten opnieuw werden geabsorbeerd. Het opnieuw uitrekken van vaste cellen maakte beeldvorming in een uitgerekte toestand mogelijk, waardoor kunstmatige vouwartefacten werden voorkomen. PDMS-membraan met een raster met patroon faciliteerde multimodale beeldvorming, waardoor lokalisatie van dezelfde cellen in fluorescentie- en scanning-elektronenmicroscopie mogelijk was. Cellen die op zachte PAA-gels zaten die waren gecoat met fibronectine, vormden alleen focale verklevingen wanneer ze werden onderworpen aan specifieke cyclische rekcycli in vergelijking met niet-uitgerekte cellen.