Het vastleggen van veelvoorkomende fragiele site-onderbrekingen door native γH2A. X Kanaal

Onze luxe richt zich op het verliezen van dating, de rol van veel voorkomende fragiele site-instabiliteit bij jive bij het opnieuw ontstaan van tumoren. Probeer virale mobiliteit in oncogen gyron kankercellen te identificeren die therapeutisch kunnen worden uitgebuit. Anders bieden beeldvorming en de sequencing-technologieën, zoals sympathie van één cel en beeldvorming van levende cellen, het in kaart brengen met hoge resolutie van genomische instabiliteit in massa.

De regio in vivo modellen inclusief ruis, genetisch gemanipuleerde muismodellen en CRISPR-basissystemen om ons heen om de mechanismen van oncogen genomische instabiliteit in detail te onderzoeken. Het langetermijnbelang van ons laboratorium is het identificeren van specifieke zwakke punten in kankercellen die strategisch kunnen worden behandeld voor geïnfecteerde behandelingen met een focus op het minimaliseren van schade aan normale cellen. Dit omvat het onderzoeken van genetische en epigenetische kwetsbaarheden om normale therapeutische mogelijkheden aan het licht te brengen.

Behandel om te beginnen de HEK 293 T-cellen gedurende 24 uur met DMSO-ethyldecoline en hydroxyureum in drie verschillende platen. Na de cellen twee keer te hebben gewassen met PBS, centrifugeer je ze op 500 G vier, vijf minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet in 500 microliter vers bereide koude buffer A en incubeer vijf tot 10 minuten op ijs.

Bekijk de lysisprogressie onder een lichtmicroscoop om de volledige cellyse te bevestigen. Eenmaal gelyseerd, centrifugeert u de celsuspensie bij 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en resuspendeert u de kernpellet in 500 microliter koude buffer A. Centrifugeer opnieuw en resustaureer de intacte kernen met 100 microliter microkokkennucleasebuffer door vijf tot 10 keer te pipetteren. Voeg onmiddellijk de vooraf bepaalde hoeveelheid microkokkennuclease toe aan de monsters.

Plaats de tubes vijf minuten op een rotator bij 37 graden Celsius. Breng de buizen onmiddellijk terug naar ijs en voeg EDTA toe om de vertering te beëindigen. Voeg na het vortexen 500 microliter buffer B toe en pipetteer op en neer om te mengen.

Incubeer de buis vijf minuten op ijs om de eiwitten op te lossen. Om het onoplosbare materiaal te pelleteren, centrifugeert u de monsters gedurende vijf minuten op maximale snelheid bij vier graden Celsius. Breng het heldere bovenstaande over in nieuwe buisjes van 1,5 milliliter, aangeduid als de natieve chromatinefractie.

Om de chromatinefragmentatie te verifiëren, wordt 10 microliter van het bovenstaande in een nieuwe buis van 1,5 milliliter gedaan. Meng het bovenstaande met 20 microliter gedestilleerd water en 30 microliter fenolchloroform-isoamylalcohol. Na krachtige vortexing centrifugeert u de buizen gedurende 10 minuten bij 20.000 G bij vier graden Celsius en observeert u drie verschillende lagen: een heldere toplaag, een witte middenlaag en een gele onderlaag.

Breng voorzichtig 20 microliter van de bovenste waterige fase, die DNA bevat, over naar een vers buisje. Scheid het gezuiverde DNA in een 1,5% agarose gel gedurende 30 minuten op 100 volt. Visualiseer de verteringspatronen en zorg ervoor dat de grootte van chromatinefragmenten voornamelijk tussen de 200 en 1.000 basenparen ligt.

Breng 20 microliter verteerd chromatine over in elke buis, die 180 microliter elutiebuffer bevat. Label de buisjes als invoermonsters en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Voeg 400 microliter verteerd chromatine toe aan een andere buis van 1,5 milliliter voor chromatine-immunoprecipitatie of chip.

Breng gamma H2 AX-antilichaam over op een met DMSO behandeld, met ethyldecolin behandeld en met hydroxyureum behandeld monster. Plaats de tubes vijf uur, of bij voorkeur een nacht, op een rotator bij vier graden Celsius. Ondertussen, met behulp van brede openingen, parelt aliquot 100 microliter magnetisch eiwit AG van chipkwaliteit in een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Plaats de buis gedurende een minuut op een magnetische standaard en gooi de vloeistof vervolgens voorzichtig weg. suspendeer vervolgens de kralen opnieuw in een milliliter PBS met 0,5% BSA. Draai de buis vier uur lang op vier graden Celsius.

Plaats de buis een minuut terug op de magnetische standaard en gooi de supernatant weg. Resuspendeer na de tweede wasbeurt de voorgecodeerde kralen in 100 microliter buffer B. Voeg 25 microliter van de voorgecodeerde magnetische kralensuspensie toe aan elke chipmonsterbuis. Draai de buizen gedurende twee uur op vier graden Celsius, plaats vervolgens de spaanbuizen op een magnetische standaard en wacht tot de kralen aan de zijkant van de buis hechten en de oplossing helder wordt.

Gooi het doorzichtige bovenstaande weg zonder de magnetische kralen te verstoren. Resuspendeer de kralen in een milliliter wasbuffer en draai ze 10 minuten op vier graden Celsius. Plaats de buisjes terug op de magnetische standaard en wacht tot de oplossing helder is voordat u de wasbuffer weggooit.

Centrifugeer de tubes na de laatste wasbeurt kort op 400 G gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius om resterende vloeistof te verwijderen. Plaats de buisjes terug op de magnetische standaard en verwijder voorzichtig alle resterende vloeistof van de bodem van de buis. Na het verifiëren van de efficiëntie van het naar beneden trekken van het chipantilichaam, met behulp van western blot, voegt u 50 microliter elutiebuffer toe aan elk van de resterende chipmonsters.

Plaats de buizen op een Therma-mixer en schud ze 15 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buisjes een minuut op een magnetische houder en vang de eluit op in nieuwe buisjes. Voeg 100 microliter elutiebuffer toe aan elk chip-elutiemonster en 180 microliter elutiebuffer aan elk invoermonster.

Voeg vervolgens 200 microliter fenolchloroform-isoamylalcohol toe aan elk monster en draai de buizen krachtig om te mengen. Breng na het centrifugeren van de monsters voorzichtig de bovenste waterige laag over op de buisjes met 19 microliter natriumacetaat met drie molaria en twee microliter glycogeenoplossing. Meng door de buizen te vortexen.

Voeg 500 microliter 100% ethanol toe aan elk monster en draai grondig. Plaats de buisjes twee uur of een nacht bij min 20 graden Celsius om het DNA neer te slaan. Centrifugeer vervolgens de buizen voordat u de supernatant weggooit en de pellet opnieuw suspendeert in een milliliter 70% ethanol.

Zodra de resterende ethanol door centrifugatie is verwijderd, drogen de DNA-pellets de DNA-pellets twee tot drie minuten aan de lucht voordat ze opnieuw worden gesuspendeerd in 400 microliter TE-buffer. Hogere concentraties microkokkennuclease leidden tot een uitgebreidere vertering van chromatine, wat resulteerde in een overwicht van mononucleosoomfragmenten. Daarentegen waren bij lagere microkokkennucleaseconcentraties de meeste chromatinefragmenten groter, vaak meer dan een kilobase.

Gamma H2 AX-niveaus waren significant verhoogd in cellen met replicatiestress, behandeld met ethyldecolin, vergeleken met met DMSO behandelde controles, zoals blijkt uit de invoermonsters voor zowel de native chip als de verknoopte chip.