Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

We doen onderzoek naar functionele genomica met een focus op het identificeren en karakteriseren van de functionele elementen binnen het menselijk genoom. Onze belangrijkste interesse gaat uit naar het verkennen van het deel van het genoom dat nog niet goed is toegewezen om hun potentiële rollen beter te begrijpen en hoe ze kunnen bijdragen aan de menselijke biologie en ziekte. De huidige tools voor omgekeerde genetica hebben enkele beperkingen, zoals niet-specifieke effecten en hoge kosten bij het maken van complexe bibliotheken van SSI's of SGI's.

Een andere uitdaging is dat deze methode zich mogelijk alleen richt op toegewezen genomische elementen, waardoor een groot deel van het genoom onderbelicht blijft. Het hier ontwikkelde protocol biedt een nieuwe benadering voor het identificeren van voorheen onbekende genomische elementen, waaronder nieuwe functionele exonen in zowel eiwitcoderende als lang coderende ogen. Gebruik om te beginnen genomisch DNA geïsoleerd uit een op lentivirus gebaseerde insertionele mutagenesecelbibliotheek als sjabloon voor een lineaire PCR in een reactie van 50 microliter. Dan.

voeg de andere benodigde reagentia toe die hier in het PCR-buisje worden getoond. Voer 50 cycli lineaire PCR uit in een standaard thermocycler onder de gegeven PCR-omstandigheden. Breng de PCR-producten over in een nieuwe, schone centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Meng de PCR-producten grondig met 10 microliter biotine-streptavidine magnetische kralen en incubeer het mengsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur, schuddend met 400 RPM in een metalen bad. Gebruik vervolgens een magnetische standaard om de kralen te verzamelen en verwijder voorzichtig de supernatant. Was de kralen zes keer met 300 microliter binding of wasbuffer en gooi het bovenstaande na elke wasbeurt weg.

Voor de synthese van de tweede streng suspendeert u de kralen in een reactievolume van 24 microliter met Klenow-fragmentbuffer, DNTP-mengsel en P5N6-primer in een PCR-buisje. Pre-incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 15 graden Celsius in een PCR-thermocycler en voeg vervolgens twee eenheden Klenow-fragment toe aan het reactiemengsel. Incubeer de mengsels in een PCR-thermocycler onder de gegeven omstandigheden.

Breng vervolgens de PCR-producten over in een nieuwe, schone centrifugebuis van 1,5 milliliter. Gebruik een magnetische standaard om de kralen op te vangen en gooi de supernatant weg. Was de kralen daarna voorzichtig met 300 microliter DNase en RNase-vrij gedestilleerd water op vier graden Celsius.

Verzamel de kralen en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de kralen in een PCR-reactievolume van 25 microliter met Taq-buffer, Taq DNA-polymerase, primer P5, DNTP-mengsel en primer 3-LTR_Nest in een PCR-buisje. Voer de PCR uit in een thermocycler met de hier getoonde instellingen.

Gebruik vijf microliter van de PCR-producten als sjabloon voor de volgende PCR-reactieronde met primer Illumina P5 en primer Illumina P73-LTR. Voer de PCR uit in een thermocycler onder de gegeven omstandigheden. Breng vervolgens de PCR-producten over in een schone centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Nadat je de kralen gedurende 30 minuten van twee tot acht graden Celsius op kamertemperatuur hebt gebracht, meng je de kralen grondig door ze om te keren of te vortexen. Pipetteer 1,2 keer het volume van de kralen in een schone centrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg de PCR-producten toe aan de korrels en meng goed door 10 keer op en neer te pipetteren.

Incubeer de kralen zodat DNA eraan kan binden. Plaats de monsters vervolgens op een magnetische standaard en verwijder het bovenstaande zodra de oplossing helder is. Was nu de kralen met 200 microliter 80% ethanol.

Incubeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur en verwijder de supernatant. Droog de kralen ongeveer vijf minuten aan de lucht bij kamertemperatuur met het deksel open. Verwijder nu de buis van de magnetische standaard.

Voeg 22 microliter DNase en RNase-vrij gedestilleerd water toe. Meng grondig door 10 keer op en neer te pipetteren en laat het twee minuten op kamertemperatuur staan. Plaats de buis terug op de magnetische standaard totdat de oplossing helder is.

Breng vervolgens 21 microliter van het bovenstaande over in een schone centrifugebuis van 1,5 milliliter. Om de concentratie met de fluorometer te meten, bereidt u de werkoplossing voor door het reagens en de buffer te mengen in een verhouding van één tot 200. Meng 10 microliter standaard één en 10 microliter standaard twee, elk met 190 microliter werkoplossing, om de teststandaarden voor te bereiden.

Draai de mengsels voorzichtig gedurende twee tot drie seconden. Bereid vervolgens het analysemonster voor door een microliter van de gezuiverde PCR-producten te mengen met 199 microliter werkoplossing. Draai het mengsel voorzichtig gedurende twee tot drie seconden.

Incubeer de analysestandaarden en analysemonsters gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, houd ze beschermd tegen licht en zet vervolgens de fluorimeter aan. Selecteer het dubbelstrengs DNA-testprogramma met hoge gevoeligheid in het hoofdmenu. Plaats voor kalibratie de standaard in de machine en druk op de knop standaard lezen om de eerste standaard te meten.

Plaats vervolgens standaard twee en druk op de knop Standaard lezen om de tweede standaard te meten. Druk voor monstermeting op de knop Monsters uitvoeren om naar de pagina voor monstermeting te gaan. Plaats elk buisje met het analysemonster en druk op de knop van het leesbuisje om de concentratie te verkrijgen.

In het monster van lage kwaliteit duidt een dominante piek rond 83 basenparen op vervuiling van het adapterdimeer. De hoogwaardige NGS-bibliotheek daarentegen vertoont hoofdpieken tussen 150 en 1.500 basenparen, wat het profiel van een succesvolle bibliotheek weerspiegelt.