Name: Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Verken de InSET-methode voor functionele genomica met behulp van insertiemutagenese in een lentivirus-gebaseerde cellenbibliotheek. Deze aanpak identificeert nieuwe functionele genomische elementen in onbekende gebieden van het humane genoom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.X. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32000441), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2023J01130), de Fundamental Research Funds voor de Central Universities van Huaqiao University (ZQN-924) en de Scientific Research Funds van Huaqiao University (18BS205). P.K. wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32170619), het Research Fund voor Internationale Senior Wetenschappers van de National Natural Science Foundation of China (32150710525) en de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2020J02006).

Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de InSET-methode. Voor optimale dekking, bereid vijf parallelle bibliotheken voor van 1 µg genomisch DNA en pool ze vervolgens voor next-generation sequencing. Deze procedure is in eerdere tests continu met succes voltooid, hoewel gebruikers op hun eigen inzicht pauzepunten kunnen invoeren. Gedetailleerde informatie over de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, is te vinden in de Tabel van Materialen.
1. Vastleggen van lentivirus-integratieplaatsen in het genoom
<ol>
	<li>Gebruik het genomische DNA geïsoleerd uit een lentivis-gebaseerde insertionele mutagenese celbibliotheek (1 µg), zoals beschreven in een eerdere studie32, als sjabloon voor een lineaire PCR in een 50 µL reactie bevattende 1x Taq Buffer, 2,5 U Taq DNA Polymerase, 4 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), en 0,3 µM van biotinyleren primer 3-LTR_prime (Tabel 1) in een PCR tube. 
	OPMERKING: De 3-LTR_prime primer bindt aan de LTR-regio van de lentivis-sequentie. Als deze bindt aan de 5' LTR, bevat het versterkte fragment de flankerende genomische sequentie. Als het bindt aan de 3' LTR, bevat het versterkte fragment een interne lentivis-sequentie, die niet kan worden uitgelijnd met het gastheergenoom en dus zal worden gefilterd tijdens downstream sequencing data-analyse. Deze primer kan ook worden aangepast om te passen bij andere soorten vectoren die worden gebruikt om een insertionele mutagenese celbibliotheek te genereren.</li>
	<li>Voer 50 cycli van lineaire PCR uit in een standaard PCR-thermocycler, waarbij 2,5 U van Taq DNA Polymerase wordt toegevoegd aan het begin en opnieuw onmiddellijk na 25 cycli. PCR-condities zijn als volgt: 94 °C gedurende 5 min; 50 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 5 min. 
	OPMERKING: Om de activiteit van de Taq DNA Polymerase tijdens langdurige reacties te behouden, wordt het aanbevolen om het enzym zowel aan het begin als in het midden van de reactie toe te voegen.</li>
	<li>Breng de PCR-producten over naar een nieuwe, schone 1,5 mL centrifugeerbuis.</li>
	<li>Meng de PCR-producten grondig met 10 µL van biotin-streptavidine magnetische kralen.</li>
	<li>Incubeer het mengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, schudden bij 400 rpm in een metalen bad. 
	OPMERKING: Neem de buis eruit om elke 15 minuten goed te mengen met de pipette.</li>
	<li>Gebruik een magnetische standaard om de kralen te verzamelen en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.</li>
	<li>Was de kralen met 300 µL Binding/Wash Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween-20) 6 keer en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was met 300 µL (65 °C) DNase/RNase-vrij gedestileerd water twee keer en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voor de tweede strengsynthese, resuspendeer de kralen in een 24 µL reactievolume bevattende 1x Klenow Fragment Buffer, 2 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), en 6,25 µM van P5_N6 primer (Tabel 1) in een PCR tube. 
	OPMERKING: Bereid een 100 µM stockoplossing van P5_N6 primer. De P5_N6 primer bestaat uit een vaste P5-adaptersequentie aan het 5'-uiteinde en een willekeurige hexameersequentie aan het 3'-uiteinde. Het willekeurige hexameer kan binden aan een diverse reeks doelsequenties, waardoor het geschikt is voor het amplificeren van verschillende DNA-fragmenten gegenereerd door lineaire PCR.</li>
	<li>Pre-incubeer het mengsel gedurende 20 min bij 15 °C in een PCR-thermocycler.</li>
	<li>Voeg 2 U van Klenow Fragment (Large Fragment E.coli DNA Polymerase) toe.</li>
	<li>Incubeer de mengsels in een PCR-thermocycler onder de volgende omstandigheden: geleidelijk verhogen met 0,5 °C/min van 15 °C naar 25 °C gevolgd door 30 min incubatie; vervolgens geleidelijk verhogen met 0,5 °C/min naar 37 °C gevolgd door 1 uur incubatie.</li>
	<li>Breng de PCR-producten over naar een nieuwe, schone 1,5 mL centrifugeerbuis.</li>
	<li>Gebruik een magnetische standaard om de kralen te verzamelen en verwijder vervolgens het supernatant.</li>
	<li>Was de kralen voorzichtig met 300 µL van 4 °C DNase/RNase-vrij gedestileerd water. Verzamel de kralen en gooi het supernatant weg.</li>
</ol>
2. Constructie van NGS-bibliotheek met geneste PCR
<ol>
	<li>Resuspendeer de kralen uit stap 1.15 in een 25 µL PCR-reactievolume bevattende 1x Taq Buffer, 1,25 U Taq DNA Polymerase, 0,5 µM van primer P5 (Tabel 1), 2 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), en 0,5 µM van primer 3-LTR_Nest (Tabel 1) in een PCR tube.</li>
	<li>Voer PCR-reacties uit in een PCR-thermocycler onder de volgende omstandigheden: 94 °C gedurende 3 min; 20 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 7 min.</li>
	<li>Gebruik 5 µL van de PCR-producten uit stap 2.2 als sjabloon voor de volgende ronde van PCR in 50 µL volume bevattende 1x Taq Buffer, 2,5 U Taq DNA Polymerase, 4 µL van dNTP Mixture (2,5 mM elk), 0,4 µM van primer Illumina_P5 (Tabel 1) en 0,4 µM van primer Illumina_P7-3LTR (Tabel 1).</li>
	<li>Voer PCR-reacties uit in een PCR-thermocycler onder de volgende omstandigheden: 94 °C

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

<ol><li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+activity+in+chromosomes+21+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22.</a> Science. 296 (5569), 916-919 (2002).</li>
<li>Bertone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+human+transcribed+sequences+with+genome+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays.</a> Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+total+nuclear-encoded+non-ribosomal+RNA+in+a+human+cell+is+%27dark+matter%27+un-annotated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA.</a> BMC Biol. 8, 149(2010).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examples+of+the+complex+architecture+of+the+human+transcriptome+revealed+by+race+and+high-density+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays.</a> Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+use+of+distal+5%27+transcription+start+sites+and+discovery+of+a+large+number+of+additional+exons+in+encode+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions.</a> Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+RNA+sequencing+reveals+the+deep+complexity+of+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome.</a> Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).</li>
<li>Deveson, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+alternative+splicing+of+non-coding+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Universal alternative splicing of non-coding exons.</a> Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).</li>
<li>Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexities+of+mammalian+transcriptome+revealed+by+targeted+RNA+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques.</a> Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).</li>
<li>Amaral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+the+human+gene+catalogue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The status of the human gene catalogue.</a> Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).</li>
<li>Mattick, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs%3A+Definitions%2C+functions%2C+challenges+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).</li>
<li>Bassik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+non-coding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 6320(2017).</li>
<li>Bester, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+genome-wide+CRISPRa+approach+to+functionalize+lncRNAs+in+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance.</a> Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+for+functional+long+non-coding+RNAs+in+human+cells+by+Cas9+targeting+of+splice+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites.</a> Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas13-based+approach+demonstrates+biological+relevance+of+vlinc+class+of+long+non-coding+RNAs+in+anticancer+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response.</a> Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).</li>
<li>Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+approaches+for+biochemical+reactions+independent+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).</li>
<li>Recinos, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-dCas13d-based+deep+screening+of+proximal+and+distal+splicing-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements.</a> Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).</li>
<li>Stojic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+RNAi%2C+LNA+and+CRISPRi+as+loss-of-function+methods+in+transcriptional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis.</a> Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).</li>
<li>Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-genetics+studies+of+lncRNAs-what+we+have+learnt+and+paths+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward.</a> Genome Biol. 21 (1), 93(2020).</li>
<li>Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+walking+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Genome walking in eukaryotes.</a> FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploid+genetic+screens+in+human+cells+identify+host+factors+used+by+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens.</a> Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+disruption+in+human+cells+to+assign+genes+to+phenotypes+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).</li>
<li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+gene+trap+collection+empowers+haploid+genetics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells.</a> Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+entry+requires+the+cholesterol+transporter+niemann-pick+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1.</a> Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).</li>
<li>Cao, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+haploid+genetic+screen+identifies+regulators+of+glutathione+abundance+and+ferroptosis+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity.</a> Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+widespread+existence+of+functional+novel+and+non-canonical+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts.</a> BMC Biol. 21 (1), 271(2023).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+An+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1303.3997%22">arXiv preprint arXiv:1303.3997</a>. , (2013).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+chip-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bedtools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking-sequence+exponential+anchored-polymerase+chain+reaction+amplification%3A+A+sensitive+and+highly+specific+method+for+detecting+retroviral+integrant-host-junction+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences.</a> Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).</li>
<li>Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+integration%3A+Site+matters%3A+Mechanisms+and+consequences+of+retroviral+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection.</a> Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+retroviral+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of retroviral integration site selection.</a> Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).</li>
<li>Ambrosi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+comparative+integration+hotspots+identify+different+behaviors+of+retroviral+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors.</a> PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen.

In forward genetics-analysen is genome-walking essentieel voor het profileren van integratieplaatsen in cellenbibliotheken voor insertionele mutagenese. Klassieke genome-walking-methoden zoals I-PCR en LAM-PCR vereisen vaak restrictie-enzymdigestie en ligatie, wat de complexiteit van de bibliotheek kan verminderen en vooringenomenheid kan introduceren vanwege afhankelijkheid van enzymlocaties27,28,29. De InSET-methode overwint d...

Functionele genoomkunde blijft een cruciaal en uitdagend veld, zelfs in het post-genoomtijdperk, met een aanzienlijk deel van genomische regio's dat nog steeds een functionele karakterisering mist. Een belangrijke reden voor deze uitdagingen ligt in de ingewikkelde aard van het menselijk genoom en transcriptoom, die worden gekenmerkt door alomtegenwoordige transcriptie en universele alternatieve splicing in zowel eiwitcoderende als niet-coderende regio's1,2,3,4,5. Deze complexiteit is uitgebreid benadrukt door RNA-gerichte verrijkingsstudies6,7,8,9. Het wordt steeds meer erkend dat talloze nieuwe genomische elementen ongekarteerd en functioneel niet-geannoteerd blijven10,11,12 naast de goed geannoteerde segmenten van het menselijk genoom.
In de afgelopen jaren zijn er vooruitgangen geboekt in reverse-genetica tools, zoals RNA-interferentie (RNAi) en CRISPR/Cas-systemen13,14,15,16,17,18,19,20,21. Deze methoden hebben echter opmerkelijke nadelen, waaronder niet-specifieke effecten en hoge kosten geassocieerd met het genereren van complexe bibliotheken van korte hairpin RNA's (shRNA's) of enkele gids RNA's (sgRNA's)22,23,24,25. Bovendien richten deze methoden zich voornamelijk op geannoteerde genomische elementen. In tegenstelling hiermee heeft voorwaartse genetica het voordeel dat het nieuwe, niet-geannoteerde functionele genomische elementen identificeert. Gezien de complexiteit van het menselijk genoom en transcriptoom, evenals het grote aantal nieuwe genomische elementen, is dit vermogen van voorwaartse genetica van aanzienlijk belang.
Voorwaartse genetica celbibliotheken worden vaak gegenereerd door willekeurige retrovirale integratie, waardoor de efficiënte detectie van genoom-wide integratieplaatsen cruciaal is voor een voorwaartse genetica assay. Het detecteren van deze integratieplaatsen omvat doorgaans genome-walking tools26. Hoewel er significante vooruitgang is geboekt in deze tools, zijn er maar weinig geoptimaliseerd voor next-generation sequencing (NGS) toepassingen en vervolgens toegepast in insertional mutagenese studies. Insertional mutagenese in cellijnen maakt vaak gebruik van methoden zoals inverse PCR (I-PCR) of lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) om integratieplaatsen te detecteren27,28,29. Deze methoden vereisen echter meestal restrictie-enzym digestie of ligatie stappen, wat de efficiëntie kan verminderen en vooringenomenheid in de resultaten kan introduceren.
Om de efficiënte detectie van genoom-wide integratieplaatsen in voorwaartse genetica screens te verbeteren, werd hier een methode genaamd de Insertion-based Screen voor functionele Elementen en Transcripten (InSET) methode geïntroduceerd. Door genome-walking te integreren met NGS, maakt InSET de hoog-doorvoer identificatie van lentivirus integratieplaatsen in lentivirus-gebaseerde insertional mutagenese bibliotheken mogelijk. In vergelijking met bestaande methoden27,28,29, is InSET relatief eenvoudig en rechtlijnig, elimineert de restrictie-enzym digestie of ligatie stappen, waardoor het gemakkelijker en toegankelijker wordt. Bovendien, hoewel de bestaande voorwaartse genetica screen in zoogdiercellen beperkt is tot zeer weinig haploïde of bijna-haploïde cellijnen27,28,29,30,31, is bewezen dat InSET werkt in aneuploïde cellijnen32.
Deze studie biedt een gedetailleerd, stap-voor-stap protocol voor het implementeren van de InSET methode. Bovendien, demonstreert het de toepassing van InSET in insertional mutagenese studies. InSET dient als een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van nieuwe exonen binnen genomische elementen, die zowel eiwitcoderende als niet-coderende RNA's in menselijke cellijnen omvatten.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Om Binding/Wash Buffer te maken</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (Ph 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Om Binding/Wash Buffer te maken</td></tr><tr><td>10× Klenow Fragment Buffer&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>10× Taq Buffer</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9659</td><td>Om Binding/Wash Buffer te maken</td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22307-1</td><td>1 µm</td></tr><tr><td>BEDTools</td><td></td><td>Software, v2</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td></tr><tr><td>BWA-MEM</td><td></td><td></td><td>Software, v0.7.12</td></tr><tr><td>dNTP Mixture</td><td>Takara</td><td>4030</td><td>2,5 mM elk</td></tr><tr><td>Equalbit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Vazyme</td><td>EQ111-02</td><td></td></tr><tr><td>fastp</td><td></td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>HiSeq X Ten</td><td>Illumina</td><td>SY-412-1001</td><td>Illumina platform, uitbesteed aan Novogene Corporation (Beijing)</td></tr><tr><td>Klenow Fragment</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>20012850</td><td>Illumina platform, uitbesteed aan Novogene Corporation (Beijing)</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>SICER</td><td></td><td></td><td>Software, v1.1</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>HuShi</td><td>30189328</td><td>Om Binding/Wash Buffer te maken</td></tr><tr><td>UltraPure Gedistilleerd Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads</td><td>Vazyme</td><td>N411-01</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

De omvang van functionele sequenties binnen het menselijk genoom is een cruciaal maar betwist onderwerp in de biologie. Hoewel high-throughput reverse genetic screens vooruitgang hebben geboekt in het onderzoek hiernaar, beperken ze zich vaak tot bekende genomische elementen en kunnen ze niet-specifieke effecten introduceren. Dit benadrukt de dringende behoefte aan nieuwe functionele genoomtools die een dieper, onbevooroordeeld begrip van de genoomfunctionaliteit mogelijk maken. Dit protocol introduceert de Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), een methode voor het identificeren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een lentivirus-gebaseerde insertional mutagenese celbibliotheek. InSET maakt de opname van genoom-brede lentivirale integratieplaatsen mogelijk, waarbij next-generation sequencing wordt gebruikt om flankerende sequenties te detecteren en te kwantificeren. De ontwerp van InSET maakt de analyse van variaties in de abundantie van integratieplaatsen in fenotypische screens op grote schaal mogelijk, waardoor het een robuust hulpmiddel is voor forward genetics en voor het identificeren van functionele genomische elementen. Een belangrijk voordeel van InSET is de capaciteit om eerder niet-geïdentificeerde genomische elementen te onthullen, inclusief nieuwe functionele exonen van zowel eiwitcoderende als niet-coderende RNA's, onafhankelijk van eerdere annotaties. Over het algemeen heeft InSET een aanzienlijke waarde in het bestuderen van de ingewikkelde complexiteit van het menselijk genoom en transcriptome, waarbij veel genomische elementen wachten op functionele karakterisering.

De kwaliteitscontrolebeoordeling van een NGS-library, die gewoonlijk door de sequencingprovider wordt uitgevoerd, dient als de standaard kwaliteitscontrole vóór de sequencing. Om de impact van de library-kwaliteit aan te tonen, werden twee monsters vergeleken. De library van hoge kwaliteit, aangeduid als s2-20-15, werd bereid volgens het standaard nested PCR-protocol, bestaande uit twee opeenvolgende amplificatiestappen: de eerste met 20 cycli, gevolgd door de tweede met 15 cycli. Daarentegen werd de library van lage kwa...

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

identification-functionally-relevant-lentivirus-integration-sites-an

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

We beschrijven de strategie van de productie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) als voertuigen voor het leveren van CRISPR/Cas9 naar de cellen. Met een vermogen om te bemiddelen snelle en robuuste gene bewerken in cellen, IDLVs presenteren een veiliger en even effectieve vector platform voor de levering van het gen in vergelijking met integrase-bevoegde vectoren.

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) systeem biedt een veelbelovend instrument voor de gentechnologie, en opent de mogelijkheid van gerichte integratie van transgenen. We beschrijven een homologie-gemedieerde einde deelname aan (HMEJ)-gebaseerd strategie voor efficiënte DNA integratie in vivo gerichte en gerichte gentherapieën met behulp van CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Verken de InSET-methode voor functionele genomica met behulp van insertiemutagenese in een lentivirus-gebaseerde cellenbibliotheek. Deze aanpak identificeert nieuwe functionele genomische elementen in onbekende gebieden van het humane genoom.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese (Video) | JoVE Journal

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Meer video's verkennen