Efficiënte methode voor het in beeld brengen van muizenlongen die de ruimtelijke dynamiek van schimmelsporen in de luchtwegen behoudt

Dit onderzoek heeft tot doel een efficiënt protocol op te stellen voor het behoud van de luchtweginhoud van muizen in longinfectiemodellen. We ontwikkelen het vermogen om de vraag te beantwoorden waar ingeademde schimmelsporen in de longen terechtkomen. Onlangs hebben veel groepen de rol geïdentificeerd van verschillende luchtwegepitheelcellen bij het detecteren van infecties en het initiëren van beschermende immuunresponsen.

Deze epitheelcellen variëren van knotscellen in bronchiën tot type II epitheelcellen in de terminale longblaasjes. De gebruikelijke longvoorbereidingstechniek is het opblazen van de long met het vloeibare fixatief om het longweefsel te bewaren voor stroomafwaartse histologische analyses. Deze techniek verplaatst echter de inhoud van de luchtwegen, zoals ingeademde schimmelsporen.

Ons protocol behoudt de natuurlijke locatie van ingeademde schimmelsporen in de long, met behoud van de juiste longmorfologie via luchtinflatie en de juiste longfixatie door vasculaire perfusie. We hopen dit protocol te gebruiken om de bronchoalveolaire juncties te karakteriseren waar sporen in ons model lijken te landen, maar we zullen de locaties van de sporen in de buurt van verschillende epitheelcellen gebruiken en de resulterende immuunresponsen bestuderen. Kleur om te beginnen één keer 10 tot de macht van zes Coccidioides posadasii-sporen met een concentratie van vijf micromolaire CFSE gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius.

Was de sporen na het kleuren met PBS. Centrifugeer de sporen bij 12.000 g en resuspendeer de pellet in 25 microliter PBS voor sporeninoculum in de juiste concentratie. Bereid een pipet voor met 25 microliter van het sporeninoculum.

Nadat je de muis in een Nalgene-pot hebt verdoofd, plaats je de muis in rugligging in één hand en laat je hem drie tot vijf regelmatig naar adem snakken. Plaats de pipetpunt aan de achterkant van de orofarynx van de muis en laat het inoculum los tijdens de inademing. Voel met hand en duim gekraak op de achterste en voorste aspecten van de borstkas van de muis om de inademing van het entmateriaal te bevestigen.

Spuit de diep verdoofde muis in met 70%ethanol. Knip met een schaar voorzichtig de huid van de muis af en trek deze vervolgens uit elkaar om het buikvlies bloot te leggen. Trek vervolgens de huid van de bovenste helft over het hoofd van de muis en bevrijd de armen.

Snijd nu het peritoneale membraan bij het borstbeen en langs het onderste deel van de ribbenkast, waardoor het peritoneum bloot komt te liggen. Verplaats de lever inferieur om het middenrif te onthullen. Gebruik een schaar om het middenrif voorzichtig weg te prikken van het longparenchym.

Snijd vervolgens de ribbenkast aan de linkerkant door om het hart bloot te leggen. Injecteer met een naald van 30 gauge vijf tot 10 milliliter PBS in de rechterventrikel. Gebruik na het verwijderen van de naald een nieuwe naald om vijf milliliter 10% neutraal gebufferde formaline in de rechterventrikel te injecteren.

Verwijder met een schaar de voorste helft van de ribbenkast. Om de luchtpijp bloot te leggen, snijdt u de bovenste ribben en sleutelbeenderen rechts en links van de nek door, waarbij u de middellijn waar de luchtpijp ligt vermijdt. Klem met een tang de resterende bovenste ribben en sleutelbeenderen vast bij de middellijn van de nek en trek naar boven totdat de luchtpijp bloot komt te liggen.

Bereid een hechtdraad van 10 centimeter voor en trek deze onder de luchtpijp. Leg vooraf een losse knoop aan het onderste uiteinde van de blootliggende luchtpijp. Bereid vervolgens een spuit van één milliliter lucht voor met een katheter van 18 katheter.

Maak met een naald van 18 gauge een gat in de luchtpijp aan het bovenste uiteinde van het blootgestelde gebied. Steek nu de katheter in het gat en zorg ervoor dat deze goed vastzit om te voorkomen dat er lucht ontsnapt. Injecteer vervolgens langzaam een milliliter lucht in de longen gedurende 10 seconden, kijkend naar het opblazen van alle longkwabben.

Volledig opgeblazen zorgt ervoor dat de longen zich iets om het hart wikkelen en het volume vullen dat in het niet-doorboorde middenrif wordt ingenomen. Nadat u de longen van de muis hebt geïsoleerd, plaatst u deze op de bovenrand van een conische buis van 50 milliliter gevuld met 20 milliliter 10% neutraal gebufferde formaline. Plaats de hechtdraden buiten de buis en schroef vervolgens de dop vast.

Spoel om te beginnen de geïsoleerde muizenlongen in PBS en plaats ze 72 tot 96 uur in een 30% sucrose PBS-oplossing bij vier graden Celsius. Verwijder daarna overtollig weefsel en plaats de longen in een cryomold met OCT-medium. Vries het preparaat in bij min 80 graden Celsius.

Breng het monster in OCT-cryoblokken gedurende een uur in evenwicht bij min 20 graden Celsius voordat u de blokken op een dikte van 20 tot 100 micrometer snijdt. Verzamel secties op een glasplaat en laat ze 30 minuten tot een uur drogen. Plaats het glaasje gedurende 30 minuten in een PBS-bad bij kamertemperatuur om OCT uit het weefsel te verwijderen.

Gebruik vervolgens een doekje om overtollige druppels van de omtrek van het objectglaasje rond het weefselmonster te verwijderen. Teken een omtrek rond het monster op het objectglaasje met behulp van een hydrofobe PAP-pen en laat het vijf minuten drogen. Voeg vervolgens 300 microliter vers bereide diervrije blokkeeroplossing toe aan de objectglaasjes en incubeer bij kamertemperatuur.

Incubeer nu het objectglaasje in 300 microliter primaire Alexa Fluor 647 geconjugeerde anti-muis EpCAM-antilichaamoplossing voor ratten 's nachts bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de antilichaamoplossing en was het glaasje twee keer met 300 microliter PBS gedurende vijf minuten. Voeg na het drogen een druppel soft-set SlowFade glazen montagemedium op kamertemperatuur toe aan elk stuk tissue.

Plaats een dekglaasje over het weefsel en zorg ervoor dat het buiten het monster en de hydrofobe markeringsomtrek uitsteekt. Plaats om te beginnen het door schimmelsporen geënte, immunogekleurde longgedeelte van de muis onder een meerkanaals fluorescerende microscoop en selecteer een geschikt objectief. Om de hele longkwab vast te leggen, verzamelt u voldoende afbeeldingstegels en voegt u ze samen.

Exporteer met de software van de microscoop het beeld van de gehele longkwab voor stroomafwaartse verwerking. Maak in QuPath een projectbestand en voeg de fluorescerende afbeeldingen toe aan het bestand. Classificeer de EpCAM-positieve pixels als epitheel door achtereenvolgens Classificeren, Pixelclassificatie en Drempelwaarde maken te selecteren.

Selecteer de resolutie, het kanaal, de afvlakkingssigma en de drempelwaarde om het doelgebied te identificeren. Sla de classificatie op onder een unieke naam en selecteer Objecten maken. Selecteer in het nieuwe venster Objecten maken de optie Nieuw objecttype als Annotatie.

Stel voor longepitheel de minimale objectgrootte en minimale gatgrootte in op 100 vierkante micrometer. Nadat u OK hebt geselecteerd, worden de annotaties gemaakt en kunnen ze worden gewijzigd met het penseel. Om sporen te classificeren, herhaalt u de stappen zoals gedemonstreerd voor longepitheelannotaties.

Selecteer vervolgens in het venster Objecten maken de optie Detectie als het nieuwe objecttype. Stel de minimale objectgrootte en minimale gatgrootte in op nul vierkante micrometer en selecteer Objecten splitsen. Als u vervolgens een ruimtelijke analyse van de sporen achtereenvolgens wilt uitvoeren, selecteert u Analyseren, Ruimtelijke analyse en berekent u de ondertekende afstand tot tweedimensionale annotaties.

De afstanden tot het EpCAM-positieve epitheel worden berekend voor elke gedetecteerde spore. Klik ten slotte op Meten, gevolgd door Metingen exporteren om de resultaten te exporteren. Sporen van Coccidioides posadasii verzamelden zich voornamelijk in distale bronchiën en nabijgelegen alveolaire ruimtes in de met lucht opgeblazen longen.

Sporen leken meer verspreid weg van bronchiën in formele en vloeistofopgeblazen longen in vergelijking met luchtopgeblazen longen. De afstand tussen sporen en EpCAM-positief bronchiolair epitheel was groter in met vloeistof opgeblazen longen in vergelijking met fysiologische luchtinflatie, wat wijst op meer verspreide sporen.