Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Ons onderzoek richt zich op de karakterisering van de Echinococcus granulosus extracellulaire blaasjes en hun rol in parasiet-gastheer interacties. We onderzoeken de opname van de samenstelling door dendritische cellen van de gastheer en de mogelijke invloed op immunomodulatie. We hebben aangetoond dat E. granulosus EV wordt opgenomen door dendritische cellen, wat de rijping en antigeenpresentatie beïnvloedt. We identificeren ook belangrijke immunomodulerende en antigene eiwitten in EV-lading, die de interacties tussen parasiet en gastheer en immuunresponsen kunnen beïnvloeden.

Ons protocol optimaliseert in vitro parasietcultuur voor verbeterde productie van kleine EV's en zorgt voor hoogwaardige isolatie en integreert dendritische celtesten om immunomodulatie te bestuderen. Het kan in zijn geheel of in delen worden toegepast. Ons toekomstig onderzoek zal de in vivo effecten van E. granulosus EV's op immuunresponsen onderzoeken, hun potentieel als vaccincomponenten en hun impact op dendritische cellen, microfagen en de immuunmodellen van deze cellen.

[Verteller] Reinig om te beginnen het ventrale oppervlak van de geëuthanaseerde muis met hydatid-ziekte met 70% alcohol. Open de peritoneale holte operatief om de ontwikkelde metacestoden te verwijderen met een schaar en een tang. Breng vervolgens de metacestodemassa's met een tang over naar een steriel petrischaaltje. Verwijder het bindweefsel met een tang, indien nodig, om de cysten los te maken van de metacestodemassa's. Was de verkregen metacestoden met aangevuld PBS bij vier graden Celsius. Bereid nu het kweekmedium voor met behulp van alle benodigde componenten en meng de oplossing voorzichtig door inversie. Breng vijf milliliter van het voorbereide kweekmedium over in elke Leighton-buis. Voeg de parasieten toe aan het kweekmedium en incubeer de buisjes vijf dagen bij 37 graden Celsius zonder het medium te veranderen. Verzamel het parasitaire kweekmedium uit elke Leighton-buis en breng deze over in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer het verzamelde medium bij 300 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en breng het bovenstaande over in een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer nu het bovenstaande bij 2.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het resulterende supernatans met behulp van een pipet over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis bij 10.000 g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om kleinere celresten te verwijderen. Breng het bovenstaande met behulp van een pipet over in een buis die geschikt is voor de ultracentrifugerotor. Markeer een kant van de tube met een stift. En plaats de buis in de rotor met de gemarkeerde kant naar boven. Centrifugeer de buisjes een uur lang bij 100.000 g bij vier graden Celsius. Giet het bovenstaande snel af en laat de tube een minuut ondersteboven rusten. Was de pellet met minimaal drie milliliter PBS om de vervuilende eiwitten te verwijderen. Resuspendeer de pellet meerdere keren met behulp van een pipet langs alle buisvlakken, met de nadruk op de gemarkeerde kant waar de pellet zich naar verwachting zal bevinden. Na herhaling van de ultracentrifugatie suspendeert u de pellet opnieuw in 30 microliter PBS. Breng het geresuspendeerde monster over in een buis van 1,5 milliliter en vries de extracellulaire blaasjes in bij min 80 graden Celsius voor opslag. Spuit de geëuthanaseerde vijf- tot acht weken oude vrouwelijke CF-1-muis met ethanol voordat u deze in een weefselkweekkap plaatst. Plaats de muis in rugligging op een snijbord. Maak met een tang en een ontleedschaar een verticale T-incisie boven de urethra en verleng deze horizontaal naar de bovenkant van de onderste ledematen. Gebruik een tang om de huid langs beide achterpoten te scheiden om de beenderen en weefsels bloot te leggen. Verwijder met de handen de huid van elk been nadat u van de enkel naar de buik hebt geduwd, waarbij u de huid naar de andere kant trekt, zodat beide benen vrij van huid blijven. Verwijder nu voorzichtig het dijbeen en het scheenbeen met een schaar en een tang en zorg ervoor dat ze niet breken. Zet de punt van elk bot vast met een tang. En snijd de pezen door om spierfascia's rond de botten te verwijderen. Voltooi het reinigen van het spierweefsel met papieren servetten. Plaats elk verwijderd bot in een steriele buis van 50 milliliter met twee milliliter aangevuld compleet RPMI-medium om vuil te verwijderen. Nadat je het medium hebt weggegooid, was je de botten twee keer met 70% ethanol gedurende vijf minuten per keer. Breng de gewassen botten over naar een steriel petrischaaltje en knip de epifysen van twee botten af met een scherpe ontleedschaar om toegang te krijgen tot de beenmergcellen. Gebruik een naald van 25 gauge die is bevestigd aan een spuit van 20 milliliter met volledig medium, en spoel de beenmergcellen voorzichtig van elk van de vier botten in een steriel petrischaaltje. Homogeniseer vervolgens voorzichtig het medium met ontsnapt merg door te pipetteren om botbindweefsel en celknobbels te verwijderen. Breng het monster over naar een steriele conische buis van 50 milliliter en leid de cellen door een steriele polypropyleen celzeef van 70 micrometer om bindweefsel en botresten te verwijderen. Centrifugeer de cellen bij 450 g gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg, zodat de pellet aan de buiswand blijft kleven. Na een minuut bij kamertemperatuur de cellen te hebben geïncubeerd, suspendeer je ze opnieuw in 500 microliter RBC-lysisbuffer en neutraliseer je de lysisbuffer met drie milliliter volledig medium. Centrifugeer de cellen bij 450 g gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet in vijf milliliter volledig medium. Nadat het monster is gefilterd, zoals aangetoond, telt u de cellen met behulp van een hemocytometer. Voeg 300 nanogram per milliliter recombinant muizen FMS-gerelateerd tyrosinekinase drie ligand, of FLT3L, toe aan het kweekmedium. Plaat de cellen in een plaat met meerdere putjes in een concentratie van één keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter. Incubeer de cellen gedurende zeven dagen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Verwijder op dag drie een milliliter medium uit elk putje zonder de cellen te verstoren en vervang het door een milliliter voorverwarmd vers compleet medium, aangevuld met 150 nanogram per milliliter recombinant muizen FLT3L. De extracellulaire blaasjes, of EV's, gezuiverd uit het larvale stadium van Echinococcus granulosus waren voornamelijk kleine EV's met afmetingen variërend van 50 tot 200 nanometer, bevestigd door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. Van beenmerg afgeleide dendritische cellen vertoonden morfologische differentiatie gedurende zeven dagen, waarbij ze zich ontwikkelden van kleine, ronde hematopoëtische cellen tot stellaatvormige cellen met cytoplasmatische extensies. Na een uur incubatie vingen de dendritische cellen fluorescerend gelabelde kleine EV's op, die co-gelokaliseerd werden met MHCIII-moleculen in endosomaal-lysosomale compartimenten, zoals bevestigd door confocale microscopie.