Transplantatie van bio-engineered long met behulp van gedecellulariseerde muizenlongen en primaire menselijke endotheelcellen

Bio-engineering van organen ter grootte van een mens vereist een grote hoeveelheid middelen, die vaak de capaciteit van academische laboratoria overschrijdt. Het verlagen van de kosten van de ontwikkeling van iteratieve protocollen zal de onderzoeksvoortgang op dit gebied versnellen. Het doel van deze studie is om het gestandaardiseerde protocol voor longbio-engineering te bieden met behulp van hart-longblokkades van muizen. Het is nog onbekend welke cellen geschikt zijn voor orgaanbio-engineering en hoe die cellen moeten worden geïntegreerd in de orgaanbioreactorcultuur. Meerdere soorten cellen en omstandigheden moeten worden vergeleken om schaalbare en reproduceerbare protocollen op te stellen.

Muizen zijn kleine en gemakkelijk te hanteren proefdieren. Hoewel ze klein zijn, is de basisarchitectuur van de long bij zoogdieren vergelijkbaar. Door het protocol op dit kleine platform te optimaliseren, kunnen we de laserdiermodellen opschalen door simpelweg de geoptimaliseerde resultaten te vermenigvuldigen op basis van de grootte van de dieren. Met dit longbio-engineeringplatform ter grootte van een muis kunnen onderzoekers hun stamcellen efficiënt testen. Deze genetisch gemodificeerde cellen kunnen kostbaar of duur zijn om te gebruiken voor de hele longtechniek. Bovendien kunnen cellen van de patiënt ook worden gebruikt om in vitro ziektemodellen te maken.

De huidige inspanningen omvatten het testen van meerdere soorten gemanipuleerde stamcellen en voorlopercellen om het vereiste proliferatiepotentieel en de differentiële capaciteit voor longbio-engineering te achterhalen. Zodra geschikte cellen zijn geïdentificeerd, zal dit onderzoek worden uitgebreid naar een groter diermodel zoals varkens.

[Verteller] Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde muis in rugligging op een operatietafel en fixeer de ledematen. Spuit 70% ethanol gelijkmatig over de borst en het buikoppervlak om het te steriliseren. Open vervolgens de buikholte langs de mediane lijn die zich uitstrekt tot aan de nek, met behulp van een roestvrijstalen schaar, en splits het borstbeen. Reseceer het middenrif van de thoracale wand. Snijd de ventrale borstwand door om de borstholtes bloot te leggen en verwijder de thymus. Met behulp van een 4/0 zijden hechtdraad, legaat de inferieure vena cava en de rechter superieure vena cava. Knip de abdominale aorta af met een roestvrijstalen schaar voor drainage. Gebruik een steriele spuit van vijf milliliter uitgerust met een naald van 27 gauge en injecteer drie milliliter steriel PBS in de rechterventrikel door de ventrikelwand te doorboren. Gebruik een Dumont-tang om een 4/0 zijden hechtdraad rond de hoofdlongslagader te lussen. Knip vervolgens een raam van twee millimeter onder de kleppen van de longslagader af, met behulp van een veerschaar, om toegang te krijgen tot de rechterventrikelwand. Breng de longslagaderkatheter door het raam en zet deze vast met de voorgeluste 4/0 zijden hechtdraad. Injecteer langzaam twee milliliter PBS door de longslagaderkatheter met behulp van een spuit van vijf milliliter. Kanuleer de luchtpijp met een tracheale katheter en bind deze op zijn plaats met een 4/0 zijden hechtdraad. Injecteer nu langzaam twee milliliter lucht door de tracheakatheter met behulp van een lege spuit van vijf milliliter. Houd de lucht 10 seconden vast om ervoor te zorgen dat er geen lucht uit de longen lekt. Verwijder de eindblokkade van het hart en de longen. Breng vervolgens het gereseceerde hart-longblok over naar een plastic petrischaal met een diameter van 10 centimeter met gedeïoniseerd water, voor de decellularisatie van de longen. Incubeer het blok een uur bij vier graden Celsius. Injecteer na de incubatie met een spuit van vijf milliliter drie keer twee milliliter steriel gedeïoniseerd water door de tracheatheter. Pauzeer na elke injectie om de vloeistof te laten ontsnappen terwijl de longen terugdeinzen. Injecteer op dezelfde manier twee milliliter water door de longslagaderkatheter. Injecteer twee milliliter 0,1% Triton X-100-oplossing in zowel de tracheale als de longslagaderkatheters. Breng het hart-longblok over naar een petrischaaltje en incubeer statisch in Triton X-100-oplossing een nacht bij vier graden Celsius. Om de Triton X-100-oplossing de volgende dag uit de longen te verwijderen, injecteert u twee milliliter gedeïoniseerd water in de tracheatheter en de longslagaderkatheter en herhaalt u dit met twee milliliter 2% deoxycholaatoplossing. Nadat u de deoxycholaatoplossing uit de longen hebt verwijderd, injecteert u twee milliliter van één molaire natriumchlorideoplossing in zowel de tracheale als de longslagaderkatheters. Incubeer het hart-longblok gedurende een uur. Nadat u de natriumchlorideoplossing met gedeïoniseerd water hebt verwijderd, injecteert u twee milliliter DNase I-werkoplossing in de tracheale en longslagaderkatheters. Incubeer het hart-longblok gedurende een uur. Injecteer steriel PBS in de tracheale en longslagaderkatheters om de DNase I-oplossing te verwijderen. Controleer na decellularisatie of de longen wit en transparant zijn aan de randen. Voeg 70 milliliter endotheelcelgroeimedium 2 of EGM-2-kweekmedia toe aan de glazen bus en plaats de siliconenstop op de bus om deze af te sluiten. Monteer een siliconen stop, een glazen bus, GL45 schroefdop met slang, een autoclaafbare glazen fles van 250 milliliter en L/S 14 slang met lokfittingen met behulp van driewegkranen. Steek een naald van 20 gauge in het siliconen septum van de GL45-schroefdop. Vul slang A, B en C met kweekmedia met behulp van een spuit van 10 milliliter die is aangesloten op kranen één en drie. Bevestig de longslagaderkatheter van het gedecellulariseerde hart-longblok aan slang C via een lokfitting. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de katheter of slang aanwezig zijn. Voor de door zwaartekracht aangedreven injectie van endotheelcellen plaatst u een celreservoir met menselijke navelstrengader-endotheelcellen, of HUVEC's, op een magnetische roerder en zorgt u ervoor dat het reservoir zich 30 centimeter boven de orgaankamer bevindt. Zet de magnetische roerder aan met een snelheid van 120 RPM. Open de kranen één en twee om de celsuspensie in de gedecellulariseerde steiger te laten stromen, via slang A, slang C en de longslagaderkatheter. Voor de perfusie van de orgaancultuur plaatst u de orgelkamer in een kooldioxide-incubator. Bevestig slang B aan een pompkop die is aangesloten op een pulserende pomp. Sluit de glazen deur van de couveuse. Zorg ervoor dat de slang goed tussen de deur en de rubberen afdichting is geplaatst. Incubeer de gedecellulariseerde steiger gedurende drie uur bij 37 graden Celsius om de endotheelcellen in de steiger te laten nestelen. Start de pomp met een snelheid van zes tpm, wat resulteert in mediaperfusie van twee milliliter per minuut met behulp van L/S 14-slangen. Observeer de gedecellulariseerde long die iets uitzet als gevolg van mediaperfusie. Sluit vervolgens de deur van de couveuse. Om de media te wijzigen, stopt u de pompaandrijving. Bevestig een steriele spuit van 50 milliliter aan kraan drie en zuig 50 milliliter media uit de kamer. Vul nog een steriele spuit van 50 milliliter met 50 milliliter voorverwarmde media. Injecteer de oplossing in een glazen bus en breng de media over in de kamer via kraan drie, waarbij u ervoor zorgt dat de kraan op de juiste manier is geschakeld. Start de pulserende pomp opnieuw op. Oogst het gerecullulariseerde hart-longblok na twee dagen perfusieorgaancultuur. De longen van muizen leken wit en doorschijnend na decellularisatie, wat wijst op de verwijdering van cellulaire componenten, met behoud van de algehele longstructuur. Histologische analyse van gedecellulariseerde muizenlongen onthulde intacte alveolaire structuren, zonder resterende cellulaire componenten. Gecellulariseerde muizenlongen met drie keer 10 tot de macht van zeven HUVEC's na twee dagen op perfusie gebaseerde bioreactorcultuur, vertoonden een homogene verdeling van HUVEC's. HUVEC's migreerden naar perifere alveolaire gebieden en vormden een capillairachtig netwerk, zoals waargenomen in gerecullulariseerde longen.