Een klinische metaproteomics-workflow geïmplementeerd binnen het Galaxy Bioinformatics-platform om gastheer-microbioominteracties te analyseren die ten grondslag liggen aan ziekten bij de mens

Onze onderzoeksfocus lag op het detecteren en kwantificeren van microbiële eiwitten en het begrijpen van hun rol in klinische ziekten. Dit onderzoeksgebied wordt klinische metaproteomics genoemd. In deze studie hebben we een bio-informatica-workflow ontwikkeld die onderzoekers in staat zal stellen te begrijpen hoe bacteriële activiteit de ziekteprogressie kan beïnvloeden.

Metaproteomische analyse van klinische monsters brengt tal van uitdagingen met zich mee, waaronder het omgaan met zeer grote eiwitsequentiedatabases voor gevoelige en nauwkeurige microbiële peptide- en eiwitidentificatie op basis van massaspectrometriegegevens, naast het uitvoeren van taxonomische en functionele annotaties van gekwantificeerde peptiden en eiwitten om biologische interpretatie van resultaten mogelijk te maken. De workflow biedt meerdere voordelen, waaronder databasereductie met behulp van onze databasereductieworkflow, de mogelijkheid om te zoeken naar microbiële peptiden met behulp van meerdere zoekalgoritmen, de mogelijkheid om microbiële peptiden te verifiëren die zijn gedetecteerd in de massaspectrometriegegevens, de mogelijkheid om de microbiële eiwitten samen met de gastheereiwitten te kwantificeren, en de biologische interpretatie van de gegevens met behulp van statistische en visuele analyse. We hebben de klinische metaproteomics-workflow gebruikt om een microbieel peptidepaneel te identificeren voor ziekteprogressiestudies naar cystische fibrose om de co-infectiestatus tijdens COVID-19-pandemiegolven te bestuderen.

Deze studies zijn gepubliceerd in peer-reviewed academische tijdschriften. We gebruiken deze workflow momenteel voor een lopende studie om een voorspellend doelwit-peptidepanel voor eierstokkanker te ontwikkelen. Het Galaxy P-team is betrokken bij multiomics-onderzoek en we ontwikkelen verschillende geavanceerde workflows voor proteogenomics- en metaproteomics-analyse.

We werken momenteel ook aan het ontwikkelen van workflows voor immunopeptidomics, die onderzoekers in staat zullen stellen peptiden te detecteren en te karakteriseren die aan het immuunsysteem worden gepresenteerd, sommige tijdens de progressie van kanker die neo-antigenen worden genoemd, en ook bij andere ziekten waarbij dit ook microbiële peptiden kunnen zijn. Verkrijg om te beginnen een lijst van soorten die verband houden met de ziekte of de aandoening van belang. Gebruik het bestand met de soortenlijst met de titel Soorten.

tabel" als de invoer voor UniProt. Download het proteoom in FASTA-formaat om een eiwitsequentiedatabase te genereren. Voer de eiwitdatabase-downloader uit om twee extra eiwitsequentiedatabases te genereren, een menselijke Swiss-Prot-database met alleen beoordeelde vermeldingen en een database met verontreinigende eiwitten met een gemeenschappelijke opslagplaats van onvoorziene eiwitten, of cRAP.

Gebruik de drie eiwitdatabases als invoer voor FASTA-samenvoegbestanden en filter unieke sequenties om duplicaten uit te sluiten. Gebruik de grote gegenereerde database en massaspectrometrie-dataset als invoer, voer MetaNovo uit om een database met gereduceerde eiwitsequenties te genereren, voer vervolgens FASTA-samenvoegbestanden uit en filter unieke sequenties op de door MetaNovo gegenereerde database, menselijke Swiss-Prot- en cRAP-databases om een gereduceerde doeldatabase te creëren met microbiële, menselijke en verontreinigende eiwitsequenties voor peptidedetectie. Voer Search GUI uit om een archiefbestand te genereren met peptidespectrumovereenkomsten of PSM's.

Gebruik het zoek-GUI"archiefbestand als invoer voor Peptide-Shaker" om de PSM-, peptide- en eiwitrapporten te genereren. Voer MaxQuant uit om eiwitgroepen en peptidebestanden te produceren. Gebruik tools voor tekstmanipulatie om de verkregen uitvoer van Search GUI, Peptide-Shaker" en MaxQuant te ordenen.

Voeg de twee peptidelijsten samen tot een enkele dataset met het label SGPS-MQ-Peptides.tabular. Groepeer de aaneengeschakelde peptidelijst om dubbele peptidesequenties te elimineren en de definitieve lijst van unieke microbiële peptiden te verkrijgen. Voer voor PepQuery2-verificatie de lijst met verschillende microbiële peptiden, MS-spectrale datasets, de menselijke UniProt-referentiedatabase met isovormen en de database met sequenties van verontreinigende eiwitten in.

Voer Cut uit op de peptiderapporten van Search GUI, Peptide-Shaker" en MaxQuant" om de peptidesequenties en bijbehorende eiwitvermeldingen te extraheren. Verbind de peptidesequenties en eiwitinvoer van beide programma's om een nieuwe gecombineerde peptide-eiwitdataset te maken en voer vervolgens de Query Tabular uit op de gecombineerde peptide-eiwitdataset en de geverifieerde peptiden om elk geverifieerd peptide toe te wijzen aan de bijbehorende eiwitinvoer. Groep om unieke geverifieerde peptiden en de bijbehorende UniProt-ID's te behouden.

Voer vervolgens Query Tabular uit om de UniProt-ID's te extraheren en een lijst met het label Uniprot-ID te genereren van geverifieerde Peptides.tabular. Upload de UniProt-ID's naar UniProt om de bijbehorende eiwitsequenties op te halen en op te slaan als een nieuw UniProt FASTA-bestand. Voer FASTA-samenvoegbestanden uit en filter unieke sequenties op de nieuw gegenereerde UniProt FASTA, de menselijke UniProt-database met isovormen en de cRAP-contaminantendatabase om een geverifieerde database voor peptidekwantificering te creëren.

Gebruik de geverifieerde eiwitsequentiedatabase en MS-dataset als invoer voor MaxQuant. Selecteer in het MaxQuant"peptiden-bestand alleen microbiële peptiden en voer Cut" uit om alleen microbiële peptidesequenties uit het selectiebestand te extraheren. Groepeer het Cut"-bestand om een lijst van gekwantificeerde microbiële peptiden samen te stellen.

Gebruik het bestand met de lijst van gekwantificeerde microbiële peptiden als invoer voor Unipept om taxonomische en functionele annotaties uit te voeren. Extraheer de Unipept-outputs, met name de microbiële taxonomieboom en de microbiële enzymcommissie-eiwitboom. Als u de microbiële taxonomie en EC-eiwitbomen wilt bekijken, selecteert u de gegevensset en opent u de opties.

Klik op Visualiseren, gevolgd door Unipept Taxonomy Viewer. Voor de taxonomische en functionele annotaties in tabelindeling klikt u op het oogpictogram van de tabelgegevensset met de naam Unipept_peptinfo. Scroll om elk peptide in zijn eigen rij en de bijbehorende kolommen met informatie te bekijken.

Voordat u statistische analyse uitvoert met MSstatsTMT, voert u Select uit op het MaxQuant"-eiwitgroepenbestand om afzonderlijke datasets voor microbiële en menselijke eiwitten te maken. Deze eiwitten bevatten taxonomie-tags die hun bron aangeven. Sluit alle verontreinigende eiwitten uit die zijn gelabeld met de tag con_.

Bewaar alleen microbiële eiwitten met tags zoals _9laco" en menselijke eiwitten met het label _human" in respectievelijk de Microbial_Proteins"tabel" en Human_Proteins"tabel. Voer ten slotte met behulp van MSstatsTMT statistische analyses uit met het MaxQuant"evidence-bestand en de geselecteerde microbiële of menselijke eiwitten. Klik op het oogpictogram om de resulterende grafieken te bekijken.

In totaal werden 2.595.745 eiwitsequenties gecompileerd in een uitgebreide database, die vervolgens werd teruggebracht tot een meer gerichte database met 21.289 eiwitsequenties voor effectieve peptide-identificatie. Met behulp van Search GUI, Peptide-Shaker" en MaxQuant werden 196 verschillende microbiële peptiden geïdentificeerd. PepQuery2 bevestigde 134 microbiële peptiden gekoppeld aan 73 eiwitsequenties, waardoor een geverifieerde database voor kwantificering werd gevormd.

MaxQuant"-analyse leverde een peptidenbestand op met 3.203 peptiden, met 155 gekwantificeerde microbiële peptiden. Unipept-analyse onthulde lactobacillus als het meest voorkomende geslacht en klasse 2-transferasen als de meest voorkomende enzymcategorie onder 155 gekwantificeerde microbiële peptiden. MSstatsTMT"-analyse produceerde vulkaan- en vergelijkingsgrafieken die differentieel tot expressie gebrachte eiwitten illustreren, wat aantoont dat drie lactobacillus-eiwitten neerwaarts gereguleerd waren in gevallen van eierstokkanker versus goedaardige gevallen.