High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

We ontwikkelen kits voor snelle en gevoelige multiplex immunofluorescentietesten. Het doel hier is om onderzoekers te helpen bij het profileren van verschillende celtypen die in FFPE-weefsel voorkomen

Immunofluorescentie wordt gewoonlijk uitgevoerd met behulp van kleurstof-gelabelde of peroxidase-gelabelde secundaire antilichamen. Immunohistochemie heeft de neiging om laag plex te zijn. Kleurstof-gelabelde secundaire antilichamen hebben last van een lager signaal. Tyramide-signaalversterkingstesten zijn moeizaam om te optimaliseren en het duurt enkele uren tot meerdere dagen om ze uit te voeren.

De markers van de assays zijn vooraf geoptimaliseerd en zijn aanzienlijk sneller dan andere technieken. Het plaatsen van vier markers duurt minder dan acht uur, en ongeveer drie uur extra voor elke extra vier biomarkers.

Het vermogen om multiplex-immunofluorescentie sneller uit te voeren, zal het mogelijk maken om ruimtelijke proteomics op grotere schaal toe te passen en zal de barrière voor het begrijpen van de ruimtelijke contextuur van weefsel verminderen.

[Verteller] Ontdooi om te beginnen alle kitreagentia bij kamertemperatuur. Bewaar de antilichaamconjugaten, het amplificatie-enzym, de uitwisselingsinitiator en de uitwisselingsneutralisator bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Vortex een ontdooid verdunningsmiddel voor antilichamen. Pipetteer het verdunningsmiddel van het antilichaam in een recipiënt. Centrifugeer kort en voeg alle antilichamen toe aan de antilichaamkleuringsoplossing 1 container. Voeg het meegeleverde antilichaamverdunningsmiddel toe in een verdunning van 1 tot 100. Gebruik vervolgens een pipet om de oplossing voorzichtig te mengen, waarbij vortex wordt vermeden. Vortex de pre-amplificatie gemengde oplossing na ontdooien om grondig te mengen. Voeg vervolgens de oplossing toe aan de betreffende mengcontainer. Vortex de amplificatiebuffer en pipet mengen het amplificatie-enzym. Verdun het amplificatie-enzym in een verhouding van 1 tot 10 in de amplificatiebuffer om de amplificatiebuffer te creëren. Meng voorzichtig door te pipetteren, vermijd vortexing. Draai en centrifugeer vervolgens de meegeleverde nucleaire tegenkleuringsoplossing en verdun 1 tot 100 in ultrapuur water. Verdun vervolgens fluorescerende sondes 1 oplossing in een verhouding van 1 tot 20 in de sondebuffer. Steek de volledige reagensstaaf in het instrument om de reagensvolumes te meten. Navigeer naar het tabblad Dia-instellingen bovenaan de software voor automatische kleuring zodra alle reagentia zijn voorbereid. Klik op de knop Onderzoek toevoegen en voer indien nodig de onderzoeks-ID, de naam van het onderzoek en eventuele opmerkingen bij het onderzoek in. Selecteer onder Doseervolume 150 microliter en kies *Dewax 4 Steps als bereidingswijze. Als het niet beschikbaar is in de vervolgkeuzelijst, opent u het menu Protocolinstellingen, markeert u het voorkeursselectievakje ervoor en klikt u op OK. Nadat het onderzoek is gemaakt, klikt u op de knop Dia toevoegen aan de rechterkant van het scherm Dia-instelling. Voer een unieke naam in voor de dia onder Diaopmerkingen. Stel het weefseltype in op Weefsel testen in het daarvoor bestemde veld. Kies vervolgens 150 microliter voor Doseervolume en stel de kleuringsmodus in op Single in de linker dropdown en Routine in de rechter dropdown. Kies onder Proces de optie IHC en stel de marker in op antilichaamkleuringsoplossing. Selecteer in het gedeelte Protocollen van het diavenster Toevoegen de optie Kleuringstest 1 voor kleuring, *Dewax 4 stappen voor voorbereiding en *HIER 20 minuten met ER2 voor HIER. Laat het enzymprotocol ingesteld op een streepje met asterisk en klik op Dia toevoegen wanneer alle velden zijn ingevuld. Nadat u alle dia's hebt toegevoegd, sluit u het venster Dia toevoegen en drukt u dialabels af, waarbij u ze op het bijbehorende weefselgedeelte plakt. Plaats elke gelabelde dia op de lade en plaats afdektegels op elk weefselgedeelte. Plaats de schuiflade in het instrument en selecteer de bijbehorende automatische kleuring aan de rechterkant van het softwarescherm. Controleer of alle drie de glaasjes en alle informatie over reagentia, inclusief bulkreagentia en bereide reagentia, zichtbaar zijn. Controleer of de bulkreagenscontainers voldoende gevuld zijn en of de afvalcontainers voldoende volume hebben om de run te voltooien. Druk vervolgens op de afspeelknop om de kleuring te starten en zorg ervoor dat de dia's tijdig van de automatische kleuring worden verwijderd zodra de procedure is voltooid. Plaats de bevlekte objectglaasjes in de PBS-buffer en breng de dekglaasjes aan met behulp van het montagemedium. Maak foto's van de objectglaasjes met behulp van een fluorescentiemicroscoop of een scanner voor hele objectglaasjes met filters die compatibel zijn met de testkleurstoffen. Ontdooi voor de uitwisselingstest de uitwisselingsbuffer bij kamertemperatuur. Bewaar de wisselneutralisator en de wisselinitiator bij min 20 graden Celsius tot ze klaar zijn voor gebruik. Bereid twee reagenstitratiecontainers voor en haal de detectiekit op voor gebruik tijdens het uitwisselingsprotocol. Vortex de uitwisselingsbuffer. En pipette, meng de uitwisselingsinitiator. Bereid de vervangingsoplossing voor in de daarvoor bestemde container door de vereiste hoeveelheden uitwisselingsinitiator en uitwisselingsbuffer te mengen. Meng de inhoud alleen door te pipetteren. Combineer nu de fluorescerende sondes 2-oplossing met de verdunde uitwisselingsbuffer in de betreffende container. Vortex alleen de sondebuffer en fluorescerende sonde, mix en pipet mengen de uiteindelijke oplossing. Plaats de volledige reagensstaaf met alle voorbereide reagentia op de autokleuring. Laat de machine een dompeltest uitvoeren op alle reagentia. Nadat u de dia's hebt toegevoegd, stelt u de markering in op *Negatief. En voor Preparaat, HIER en Enzym selecteert u de optie voor het asterisk-streepje, aangezien er geen dewaxing of antigeenverzameling nodig is voor het uitwisselingsprotocol. Klik op Dia toevoegen als u klaar bent. Nadat alle dia's zijn toegevoegd, sluit u het venster Dia toevoegen en drukt u dialabels af die op elke corresponderende weefselsectie moeten worden geplakt. Plaats elke dia op de lade en plaats een afdektegel over elk weefselgedeelte voordat u de lade in de automatische kleuring plaatst. Druk nu op de afspeelknop om de run te starten. Beelden van een weefselmicroarray-kern vastgelegd over twee kleuringsrondes met behulp van een acht-plex immunofluorescentieprotocol toonden verschillende immuunmarkers in elke ronde, met succesvolle co-registratie van afbeeldingen die beide rondes combineerden tot een verenigde composiet. Beeldvorming van colorectaal kankerweefsel maakte identificatie van immuunfenotypes mogelijk op basis van colokalisatie van markers, waaronder regulerende T-cellen, uitgeputte T-cellen en immuunonderdrukkende macrofagen. Immunofluorescentiekleuring toonde co-expressie van CD3, CD4 en FoxP3 in regulerende T-cellen. PD1 en PDL1 in tumor- en stromale cellen. CD3, CD8 en PD1 in uitgeputte cytotoxische T-cellen. En CD 68 en PDL1 in immuunonderdrukkende macrofagen. Vergelijking van immunohistochemie met één marker en immunofluorescentie met enkelvoudige of multiplex bevestigde kwalitatieve overeenstemming in kleuringspatronen over alle markers. Seriële doorsnedekleuring over verschillende weefseltypen bevestigde consistente expressiepatronen van immuunmarkers met representatieve weefselkernen, met succesvolle kleuring en minimale variabiliteit. Amandelsecties gekleurd in zes seriële dia's voor CD8 vertoonden een hoge reproduceerbaarheid met een bijna identieke signaalverdeling over alle afbeeldingen. Kwantificering van marker-positieve celdichtheden in weefseltypen toonde de hoogste dichtheden in amandelen en lymfeklieren, en het laagst in melanoom en dikke darm.