Zuivering, expansie en op flowcytometrie gebaseerde fenotypering van van muizen afgeleide beenmergmesenchymale stamcellen

Ons onderzoek biedt een goedkope methode om homogene mesenchymale stamcellen van muizenbeenmerg te zuiveren en uit te breiden. Dit helpt onderzoekers om voldoende cellen van hoge kwaliteit te krijgen met een sterk groei- en differentiatievermogen. Een belangrijke uitdaging bij het onderzoek naar beenmergstamcellen is het ontwikkelen van een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren van mesenchymale stamcellen van het beenmerg. Deze methode laat mesenchymale stamcellen van het beenmerg lateraal groeien door verstoring te voorkomen. Het maakt gebruik van derde passaging, vermijdt extra groei-effecten en houdt hematopoëtische cellen in de buurt om de gezondheid en functie van de stamcellen te ondersteunen.

[Docent] Week om te beginnen de geëuthanaseerde muis vijf minuten in 75% ethanol. Maak met een steriele dissectieschaar een incisie van ongeveer een centimeter in de achterpoot, nabij de achillespees. Voer vervolgens een cirkelvormige incisie uit rond de achterpoot om het distale scheenbeen bloot te leggen. Pel de huid van de incisieplaats omhoog naar de heup om de huid van beide achterpoten te verwijderen. Snijd langs het darmbeen om de heupkop los te maken van het heupbeen. Gebruik een steriel scalpel om zoveel mogelijk pees en spieren uit het scheenbeen en kuitbeen te verwijderen om het latere blozen te vergemakkelijken. Leg de schoongemaakte botten terug in de schaal met PBS met 2% penicilline en streptomycine voordat u ze in een steriele kap doet. Neem een spuit van 50 milliliter en bevestig de naald die bij de spuit wordt geleverd. Vul de spuit met 20 milliliter alfa MEM-medium en vervang de naald door de naald die bij de spuit van één milliliter wordt geleverd. Gebruik in de steriele kap een schaar om beide uiteinden van het gescheiden dijbeen of scheenbeen af te knippen. Steek nu de naald in het bot aan de snijkant en spoel het beenmerg in een celkweekschaaltje van 100 millimeter met compleet alfa MEM-medium. Ga door met spoelen totdat het bot zichtbaar bleek wordt, wat wijst op een succesvolle mergextractie. Pipetteer 40 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van één milliliter om eventuele celaggregaten te dispergeren. Filter nu de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer in een centrifugebuis van 50 milliliter om vuil, weefselfragmenten en niet-verspreide klonten te verwijderen. Stel het totale volume in op 15 milliliter met het volledige alpha MEM-medium en breng de gefilterde celsuspensie over in een kweekschaaltje van 100 millimeter. Houd de schaal met beide handen vast en draai hem voorzichtig 15 keer rond in een achtvormige beweging om de cellen gelijkmatig over de schaal te verdelen. Zet de kweekschaal tot slot in een incubator van 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en kweek gedurende vijf dagen. Deze figuur illustreert de morfologische progressie van stromale beenmergcellen vanaf de eerste extractie tot de derde passage in cultuur. Vers geëxtraheerde beenmergcellen verschenen overwegend mononucleair met verspreide vetdruppels die door het hele veld zichtbaar waren. Tegen de vijfde dag van de kweek begonnen spoelvormige cellen te verschijnen en bereikten ze een samenvloeiing van ongeveer 60% tot 80%, en op dag zeven bleef de dichtheid toenemen. Van passage één tot passage drie behielden stromale beenmergcellen een spoel- of spoelvormige morfologie, vormden ze een duidelijke monolaag met onderling verbonden kolonies en vertoonden ze geen tekenen van apoptose zoals cytoplasmatische granulariteit of nucleaire fragmentatie. Flowcytometrie bevestigde dat CD29, CD44 en Sca-1 sterk tot expressie kwamen in stromale beenmergcellen. De expressie van CD31- en CD45-markers van endotheliale en hematopoëtische lijnen was verwaarloosbaar. Kwantificering van markers bevestigde verder hoge expressieniveaus van CD29, CD44 en Sca-1 in vergelijking met CD31 en CD45.