Evaluatie van celdoodsignalering door immunofluorescentie in een rattenmodel van ischemische beroerte

Ischemische beroerte is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en invaliditeit. Ons werk is gericht op medicijndoelen voor beroertes. We zijn geïnteresseerd in verschillende opkomende doelen, zoals RUNX1 en cathepsines. Om deze doelen te evalueren, ontwikkelden we een rattenmodel van ischemische beroerte door de middelste hersenslagader af te sluiten.

We modelleren ischemische beroerte bij ratten door een filament in te brengen om de middelste hersenslagader af te sluiten. Het occluderende model van de middelste hersenslagader is het meest gebruikte knaagdiermodel voor preklinische onderzoeken naar beroertes in combinatie met andere technieken, zoals TTC, immunofluorescentie en de TUNEL-kleuring. We kunnen de pathofysiologie van een beroerte onderzoeken in een geïntegreerde benadering. Er zijn enkele technische uitdagingen voor immunofluorescentie, zoals de specificiteit van antilichamen die de achtergrond van fluorescentie minimaliseren en de signaal-ruisverhouding optimaliseren door gebruik te maken van de eigenschappen van fluorescentielabels en de specifieke antilichamen. Immunofluorescentie stelt ons in staat om het ingewikkelde landschap van cellulaire architectuur en de moleculaire interacties met het occluderende model van de middelste hersenslagader te begrijpen.

Een aantal hersenweefsels is mogelijk te redden met een geschikt tijdvenster van de beroerte. Onze resultaten tonen aan dat de expressie van cathepsine B wordt geactiveerd in het aantal rattenhersenen na occlusie van de middelste hersenslagader. Het gaat gepaard met verhoogde apoptose. Verdere studies naar het mechanisme dat ten grondslag ligt aan celdoodsignalering kunnen een nieuw doelwit voor het geneesmiddel opleveren.

In onze toekomstige studie zullen we doorgaan met het onderzoeken van potentiële moleculaire doelwitten in ontstekingsroutes en celdoodsignalering. We hopen dat sommige van deze doelen die door experimentele studies zijn ontdekt, kunnen worden vertaald in klinische therapie, waardoor de overleving en de kwaliteit van leven van patiënten met een beroerte worden verbeterd.

[Verteller] Plaats om te beginnen de verdoofde rat in rugligging en houd zijn lichaamstemperatuur op 36,5 °C met behulp van een gereguleerde warmtemat en een rectale temperatuurmonitorsonde. Scheer de huid van de hals en desinfecteer deze met een desinfecterende oplossing voor jodofoor. Maak vervolgens een incisie van 2 cm in de middellijn in de nek en trek de zachte weefsels terug om de halsslagaders bloot te leggen. Isoleer met een tang de rechter gemeenschappelijke halsslagader, of CCA, externe halsslagader, ECA en interne halsslagader, ICA. Ligate de proximale rechter CCA met behulp van hechtingen. Klem vervolgens de juiste ICA en ECA bij de oorsprong vast met een microclip. Steek een nylon monofilament bedekt met een ronde siliconen punt in het lumen van de CCA via een kleine incisie en leg een knoop in de CCA om bloeden en losraken van het monofilament te voorkomen. Open de rechter ICA-microclip en steek het monofilament in de rechter middelste hersenslagader, of MCA, via de ICA-stomp totdat de siliconenpunt de oorsprong van de MCA afsluit. Snijd het blootgestelde deel van het nylon monofilament af en sluit de incisie in de middellijn van de nek. Na twee uur MCA-occlusie opent u de incisie in de nek en maakt u de knoop in de CCA los. Trek vervolgens het nylon monofilament terug om de MCA te vervangen. Observeer de rat na de operatie tijdens het herstel van de anesthesie in een verwarmde kooi die wordt onderhouden met een verwarmingsmat met temperatuurregeling. Met behulp van de Zaya Long Behavioral Rating Scale evalueert u de neurologische functie twee uur na occlusie van de middelste hersenslagader, of MCAO, en 22 uur na reperfusie. Nadat de hele hersenen van de MCAO-modelrat zijn geïsoleerd, bevriezen we de hersenen gedurende 20 minuten bij -20 °C. Snijd de bevroren hersenen in zes coronale plakjes met een afstand van 2 mm tussen de plakjes. Kleur de plakjes 15 minuten met 2% TTC bij 37 °C in het donker. Fixeer vervolgens de hersenplakjes met 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Fotografeer de bevlekte plakjes met een digitale camera die is ingesteld op de automatische modus voor close-upobjecten. Breng de afbeeldingen over naar een computer en gebruik ImageJ-software om de grootte van het infarct te meten. Bereken de grootte van het infarct als de verhouding van de som van het infarctgebied in alle zes plakjes tot de som van het totale hersengebied in dezelfde plakjes. Significante infarctgebieden werden waargenomen in de MCAO-groep vergeleken met geen infarct in de schijngroep. Fixeer voor immunofluorescentieanalyse de intacte hersenen van de MCAO-modelrat gedurende 24 uur in 4% paraformaldehyde. Droog vervolgens de hersenen uit in een reeks gradiënten van sucroseoplossing in concentraties van 10%, 15% en 30%, in concentraties van 10%, 15% en 30%, en ga door totdat het weefsel zinkt. Veranker het uitgedroogde brein in een optimale snijtemperatuurverbinding en verwijder eventuele luchtbellen. Bevries de hersenen in vloeibare stikstof. Op een cryostaat worden de hersenen doorgesneden met een dikte van 5 μm. Nadat u de bevroren hersensecties op kamertemperatuur hebt geëquilibreerd, wast u ze drie keer met steriel PBS gedurende elk 5 minuten. Omlijn het weefsel met een immunohistochemiepen voordat u gedurende 10 minuten incubeert met 20 μg per ml proteïnase K en 0,3% Triton X-100 bij kamertemperatuur. Breng na het wassen van de secties met PBS 3% BSA aan op het omlijnde weefsel en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur om te blokkeren. Vervang de blokkeeroplossing door het juiste primaire antilichaam en incubeer de coupes een nacht in het donker bij 4 °C. Was de secties de volgende dag drie keer met steriel PBS met 0,1% Tween-20 gedurende elk 5 minuten. Voeg het juiste secundaire antilichaam geconjugeerd aan de vereiste fluorofoor toe en incubeer de secties gedurende een uur in een bevochtigde kamer, waarbij ze tegen licht worden beschermd. Na het wassen van de secties met PBS met Tween-20, bevlekt u ze met een montagemedium dat DAPPI bevat en dek ze af met dekglaasjes. Stel op een fluorescentiemicroscoop de excitatiegolflengte in op 488 nm, de emissiegolflengte op 520 nm en de belichtingstijd op 500 ms om gekleurde hersensectie im vast te leggenLeeftijden. De immunoreactiviteit van cathepsine B was significant verhoogd in de ischemische kern van de MCAO-groep in vergelijking met de schijngroep. De immunoreactiviteit van cathepsine B was significant verhoogd in de penumbracortex van de MCAO-groep in vergelijking met de schijngroep. Er werd geen significant verschil in cathepsine B-immunoreactiviteit waargenomen tussen de ischemische kern en de penumbrale cortex. Om te beginnen, dehydrateer de paraformaldehyde gefixeerde hersenplakjes van de MCAO-modelrat in toenemende ethanolconcentratie gedurende elk 35 tot 50 minuten. Behandel vervolgens de hersenschijfjes met terpentijnolie type transparant biologisch middel 1 gedurende 35 tot 50 minuten, gevolgd door klaringsmiddel 2 gedurende 35 tot 50 minuten totdat het weefsel volledig transparant is. Dompel nu hersenplakjes onder in het insluiten van mediums 1, 2, 3 en 4 achtereenvolgens 60 minuten elk. Plaats hersenplakjes in een inbeddingscassette, sluit ze goed af en bewaar ze in een koude opslag om te stollen. Snijd met behulp van de microtoom het weefselblok af bij 10 μm en plak vervolgens bij 5 μm. Laat de weefselcoupes 30 seconden in een waterbad van 45 °C drijven en leg ze vervolgens op objectglaasjes. Deparaffineer na het drogen de hersensecties in een klaringsmiddel gedurende twee cycli van elk 10 minuten. Rehydrateer vervolgens de hersensecties in afnemende ethanolconcentraties. Spoel de sectie nu drie keer in PBS gedurende elk vijf minuten. Nadat het overtollige vocht is verwijderd, voegt u 100 μL proteïnase K toe aan elke sectie en incubeert u gedurende 20 minuten bij 37 °C. Breng na PBS-wasbeurten 100 μL terminale deoxynucleotidyltransferase-evenwichtsbuffer aan op elk monster en incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 10 tot 30 minuten. Verwijder de buffer met absorberend papier en voeg 50 μL etiketteringsoplossing toe uit de TUNEL-testkit. Breng vervolgens de DAPPI-werkoplossing aan op de secties en incubeer vijf minuten in het donker om de kernen tegen te gaan. Spoel de monsters in PBS vier keer gedurende 5 minuten elk. Verwijder overtollige vloeistof en sluit de schuif af met een anti-fade montagemedium. Scan het gekleurde glaasje met behulp van het Vectra Polaris multispectrale beeldvormingssysteem. TUNEL-kleuring vertoonde een significante toename van apoptose, met meer TUNEL-positieve cellen in de penumbrale cortex van de MCAO-groep in vergelijking met de schijngroep.