Time-Lapse Epifluorescentiemicroscopie Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Heterogene fenotypes

Het onderzoek van ons lab richt zich op waarom antibiotica falen. We zijn met name geïnteresseerd in de weinige cellen die persisters worden genoemd in de bacteriepopulaties die zogenaamd door het antibioticum moeten worden gedood, maar ze kunnen een antibioticabehandeling overleven. En men denkt dat deze persisters ervoor zorgen dat infecties terugvallen nadat de antibioticabehandeling voorbij is.

We zijn dus geïnteresseerd in het kijken naar de genexpressie en het metabolisme van deze persisters om hun overlevingsstrategieën beter te begrijpen. De huidige uitdaging voor het persisterveld is om de doorvoer in evenwicht te brengen met de gevoeligheid van één cel. We moeten het vermogen van een enkele cel om zich na de behandeling te delen, waardoor het als een persister wordt gekwalificeerd, matchen met een meetbaar fenotype dat ons kan helpen de innerlijke werking van de cel te begrijpen.

En misschien moeten we dit doen voor duizenden cellen om zelfs maar een enkele persister te vangen. Ons protocol is ontwikkeld om gemakkelijk te kunnen worden geïmplementeerd in vergelijking met onnauwkeurige agar-sandwichmethoden of de fabricage van microfluïdische apparaten, wat technisch uitdagend kan zijn. We ontdekten dat ons protocol in de loop van de tijd reproduceerbare en stabiele beeldvorming oplevert met minimale materialen, wat betekent dat het zowel kosteneffectief als minimaal verspillend is voor het verzamelen van kwaliteitsgegevens.

Ons toekomstig onderzoek zal een combinatie van omics en single cell-benaderingen gebruiken om te bestuderen hoe pathogenen reageren op en herstellen van behandeling met verschillende klassen antibiotica. Ons uiteindelijke doel is om dit inzicht te benutten om nieuwe strategieën te ontwikkelen voor het verbeteren van de behandeling van klinische infecties. Plaats om te beginnen een steriele afdekplaat van 30 millimeter in de bodem van de roestvrijstalen basis van een verwisselbare afdekschaal.

Draai het inzetstuk van polycarbonaat voorzichtig in de basis, zorg ervoor dat de afdekstrip de basis van de kamer vormt en sluit deze op zijn plaats af door de bijgevoegde siliconen O-ring samen te drukken. Plaats een op maat gemaakte 3D-geprinte verdeler tegen de 30 millimeter afdekstrip om te voorkomen dat modale cellen kruisbesmetting krijgen. Bereid 1,5% agarose in een conische tube van 50 milliliter met behulp van het medium naar keuze en draai voorzichtig om te mengen.

Draai de dop van de conische buis los en plaats deze in een glazen beker of magnetronbestendige houder. Zet het agarosemengsel in de magnetron op hoog vuur en stop elke drie tot vier seconden om te wervelen en te mengen om overborrelen te voorkomen. Controleer na een minuut of er nog geen gesmolten agarose in het mengsel zit.

Als de agarose gelijkmatig helder is, laat hem dan kort afkoelen tot ongeveer 60 graden Celsius. Voeg de relevante antibiotica of matrijzen toe en draai voorzichtig om te mengen, vermijd luchtbelvorming. Pipetteer twee milliliter van de agarose in de kamer met de 30 millimeter dekslip.

Leg voorzichtig een steriel afdekglaasje van 25 millimeter over de agarose in de opening van de bovenste kamer. Laat de pad één tot twee uur stollen. Wanneer het kussen gestold is, gebruikt u een permanente marker met fijne punt om de locaties en identiteiten van elk monster op het afdekglaasje van 25 millimeter te markeren.

Keer de kamer om zodat de roestvrijstalen basisring naar boven wijst en houd het inzetstuk van polycarbonaat eronder voorzichtig vast terwijl u de basis losmaakt. Zet de roestvrijstalen basis opzij. Schuif de 30 millimeter afdekstrip van de agarosepad en gooi deze weg.

Verdun de Pseudomonas aeruginosa of Staphylococcus aureus celculturen in PBS tot een schaarse dichtheid die geschikt is voor het visualiseren van afzonderlijke cellen. Pipetteer krachtig op en neer om de cellen gelijkmatig te verdelen. Spot vijf microliter van de verdunde celsuspensies op de gemarkeerde plaatsen op het agarosepad.

Zodra de vlekken zijn opgedroogd, plaatst u een nieuwe steriele afdekplaat van 30 millimeter over de pad. Houd vervolgens het polycarbonaat inzetstuk met één hand vast en rijg de roestvrijstalen basis langzaam weer over de dekslip. Zodra de kamer is afgesloten, controleert u of de agarose contact maakt met het oppervlak van de 30 millimeter dekglaas.

Druk met het stompe uiteinde van een pincet voorzichtig tegen het 25 millimeter dekglaasje totdat de agarose het 30 millimeter dekglaasje gelijkmatig over het oppervlak raakt. Bereid om te beginnen de omgevingscontroles van de microscoop en de beeldkamer voor door de temperatuur van de topincubator en de incubator met grote kamer in te stellen op 37 graden Celsius. Schakel vervolgens de kamerbevochtiger in.

Plaats een agarosepadpreparaat in de bovenste couveuse van de fase en sluit de kamer om evenwicht mogelijk te maken. Bereid de MetaMorph-software voor op beeldacquisitie door het ingebouwde autofocusalgoritme te configureren om het fasekanaal te gebruiken tijdens multidimensionale acquisitie. Stel op het tabblad Fase meerdere faseposities in voor elk monster, waarbij u zich richt op gezichtsvelden met een gelijkmatig verdeelde celdichtheid.

Configureer vervolgens op het tabblad Time-Lapse de duur en frequentie voor beeldacquisitie. Stel op het tabblad Golflengten de gewenste kanalen voor acquisitie in en pas de belichtingstijden aan op basis van de signaalintensiteit van het monster. Zodra het agarosekussen in de kamer is opgewarmd, plaatst u het bevochtigingsdeksel op de podiumbroedmachine.

Schakel vervolgens op de microscoop over van fasecontrast naar differentiële interferentiecontrastmodus. Pas de condensor en het diafragma aan om de juiste Kohler-verlichting te bereiken. Schakel na het voltooien van de aanpassingen terug naar de fasecontrastmodus.

Navigeer naar elke stagepositie, pas de focus aan en reset de stagepositie naar het nieuwe brandpuntsvlak. Klik op de knop Verwerven om de multidimensionale acquisitie te starten. Om na de acquisitie afbeeldingen samen te stellen, opent u MetaMorph en gebruikt u de Review Multidimensional Data-app om de gewenste kanalen of golflengten te selecteren en alle tijdstippen voor elke fasepositie op te nemen.

Klik op Afbeeldingen laden en sla elke compilatie met de bijbehorende kanaalnaam op als een TIFF-bestand. Time-lapse-beeldvorming van Staphylococcus aureus-cellen werd uitgevoerd waarbij propidiumjodidekleuring werd aangetoond naarmate de antibioticabehandeling vorderde, wat duidde op membraanschade. Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa tijdens een antibioticabehandeling toonde cellen die sferoplastvorming, filamentatie en cytoplasmatische condensatie ondergaan, vergezeld van propidiumjodidekleuring.

Succesvolle bereiding van agarosepads en beeldvormingsomstandigheden maakten observatie mogelijk van Staphylococcus aureus die herstelde van een antibioticabehandeling en Pseudomonas aeruginosa die herstelde van een antibioticabehandeling om grote clusters te vormen die waren afgeleid van afzonderlijke cellen.