Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota

Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota. Protocol. Ten eerste, eiwitproductie en -zuivering. Constructie van de expressievector.

Verkrijg de genclustersequentie GenBank LC422372.1 van NCBI. Kloon de genen in een gemodificeerde pET-28a-vector. Transformeer de plasmiden in E.coli BL21 DE3-competente cellen.

Kweek vervolgens de bacteriën in LB-medium met 50 microgram per milliliter kanamycine bij 37 graden. Voeg 0,2 millimol IPTG toe aan het medium wanneer de bacteriedichtheid OD600 0,6 bereikt. Kweek de bacteriën 16 uur lang op 16 graden.

Centrifugeer de bacteriecultuur bij 4.000 keer g bij vier graden. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de bacteriële korrel. Resuspendeer de bacteriële pellet in Buffer A.Zuivering van eiwit.

Voeg één millimol PMSF toe aan de bacteriële resuspensie. Lyseer de bacteriënsuspensie door een ultrasone celbreker. Centrifugeer het bacteriële lysaat op 48.000 keer g gedurende 40 minuten op vier graden.

Zuiver het eiwit in het bovenstaande met behulp van de nikkelaffiniteitschromatografie NTA-kolom. Elueer het gebonden eiwit met Buffer B in een gradiënt. Verzamel monsters met een hoge UV-absorptie van 280 nanometer en heldere eiwitbanden van SDS-PAGE voor de volgende stap.

Dialyseer de monsters tegen Buffer C.Zuiver het gedialyseerde eiwit met behulp van een ionenuitwisselingschromatografiekolom. Bind het doeleiwit aan de kolom met Buffer C.Elute het gebonden eiwit met Buffer D ingrediënt. Zuiver het eiwit met behulp van een kolom met uitsluiting van grootte met Buffer E.Verzamel eiwitmonsters voor de volgende stap.

Concentreer de eiwitmonsters tot 20 milligram per milliliter, aliquot het, vries het snel in met vloeibare stikstof. Bewaar het op 80 graden voor toekomstig gebruik. Meet de eiwitconcentratie met QuickDrop met UV 280 nanometer.

Circulair dichroïsme, CD, verzameling van spectrumgegevens. Verdun de eiwitten tot 0,2 milligram per milliliter in één keer PBS-buffer, pH 7,4. Stel de scansnelheid van het instrument in op 50 nanometer per minuut en de spectrale bandbreedte op één nanometer.

Verzamel CD-spectrale gegevens in het golflengtebereik van 200 tot 260 nanometer. Trek de PBS-achtergrond af en neem de gemiddelde waarde van drie metingen. Twee, eiwitkristallografie en gestructureerde bepaling.

Groei en optimalisatie van eiwitkristallen. Voer de eerste kristallisatiescreening uit met behulp van de zit-druppelmethode met behulp van de eiwitkristallisatiekits op kristalplaten met 48 putjes. Stel de neerslag- en eiwitconcentratiegradiënten in om de eiwitkristallisatie te optimaliseren met behulp van de ophang-druppelmethode.

Breng de kristallen over naar een weekoplossing met reservoirbuffer en doelverbindingen op 16 graden gedurende 30 minuten na volledige groei. Breng kristallen over naar een cryoprotectieve oplossing met kristallisatiebuffer aangevuld met 25% glycerol en onmiddellijk opgeslagen in vloeibare stikstof voor gegevensverzameling. Gegevensverzameling en gestructureerde bepaling van eiwitkristallen.

Verzamel de volledige set röntgendiffractiegegevens op de bundellijnen van de SSRF van de NFPS met behulp van een invallende golflengte van 0,978 angstrom. Verwerk kristaldiffractiegegevens in eerste instantie met behulp van het programma kristallografische gegevensverwerkingssoftware. Voer de fasering uit met behulp van een automatisch gegevensverwerkingsprogramma.

Gebruik software voor het bepalen van de kristalstructuur voor het automatisch verfijnen en optimaliseren van structuurmodellen. Drie, monitoring van reactieactiviteit en bepaling van kinetische parameters. Monitoring van de DgpA/B/C-activiteit door HPLC.

Monteer het C-glycoside-splitsingsreactiesysteem in PBS-buffer, pH 7,4, met 20 micromol per milliliter DgpA/B/C, één millimol per liter mangaanion, één millimol per liter NAD, 10 millimol per liter DTT en 0,1 millimol per liter substraat, puerarin, daidzin, genistin. Meng grondig door te pipetteren en incubeer gedurende acht uur bij 37 graden. Voeg driemaal de hoeveelheid methanol toe aan het reactiesysteem om de reactie te beëindigen.

Centrifugeer de reactieoplossing bij 16.000 keer g gedurende 15 minuten om het neerslag te verwijderen. Filtreer het bovenstaande met behulp van een filtermembraan van 0,22 micrometer. Voer HPLC-analyse uit met gradiënt-elutie met een debiet van één milliliter per minuut, detectiegolflengten van UV 265 nanometer en een injectievolume van 10 microliter.

Monitoring van DgpA-activiteit met 2,6-dichloorfenol-indofenol, DCPIP, assay. Incubeer 0,8 millimol per liter DCPIP, 50 micromol per liter eiwit en 10 millimol per liter substraat in één keer PBS-buffer, pH 7,4. Registreer na 20 uur reactie de absorptieverandering van DCPIP bij 600 nanometer met behulp van een microplaatlezer.

Bepaling van de remmingssnelheid van glucose op de C-glycosidische bindingssplitsingsreactie van puerarin. Voer de reactie uit in een PBS-buffer van één keer met een pH 7,4 bij verschillende glucoseconcentraties ten opzichte van het reactiesysteem, zoals beschreven in punt 3.1. Voer de reactie uit bij 37 graden gedurende 12 uur.

Voer een kwantitatieve analyse uit van de gegenereerde producten met behulp van HPLC. Bepaling van kinetische parameters. De concentratie van puerarin is vastgesteld op 0,01 tot vier millimol per liter, en die van daidzin en genistin was van 0,01 tot twee millimol per liter in de DgpA/B/C C-glycoside-splitsingsreactie.

Voer de reactie gedurende acht uur uit bij 37 graden volgens de in punt 3.1 beschreven methode. Leid de kinetische parameters van Km en kcat af door de berekende reactiesnelheid en substraatconcentratie aan te passen aan een Michaelise-Menten-model in Prism. Vier, bereiding en detectie van reactietussenproduct.

Bereiding van het reactietussenproduct. Gebruik daidzin en genistin als substraten om de reactie uit te voeren volgens de methoden beschreven in paragraaf 3.1 met een reactiesysteem van 90 milliliter. Zuiver het tussenproduct met behulp van een preparatief HPLC met een preparatieve vloeistofchromatografiekolom.

Droog de gezuiverde tussenproducten met een vacuümcentrifugaalconcentrator voor toekomstig gebruik. Karakterisering van reactietussenproduct met LC-MS. Los een deel van de gezuiverde tussenproducten van de daidzin- en genistinereacties op in methanol om oplossingen van elke verbinding te bereiden met 50 microgram per milliliter.

Centrifugeer bij 13, 500 keer g gedurende 10 minuten en verzamel de uspernatantia voor LC-MS/MS-analyse. Gebruik hetzelfde gradiënt-elutieprogramma als in de HPLC-analyse voor LC-MS-analyse met een injectievolume van vijf microliter. Karakterisering van reactietussenproduct met NMR.

Los een deel van de gezuiverde tussenproducten van de daidzin-reactie op in dimethylsulfoxide-gedeutereerd zes voor proton- en koolstof-13 NMR-spectroscopie. Registreer de NMR-spectra op een NMR-instrument bij 400 megahertz voor een proton. Registreer de NMR-spectra op een NMR-instrument bij 175 megahertz voor koolstof 13.

Representatieve resultaten. Over het algemeen hebben we een gecombineerde experimentele benadering ontworpen die eiwitproductie en -zuivering, kristallisatie-experimenten, activiteitstesten en de identificatie van reactieproductstructuren in figuur één omvat. Concreet hebben we eiwitten met een hoge zuiverheid verkregen door middel van een driestaps zuiveringschromatografie, ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratiechromatografie in figuur twee.

In de kristallisatie-experimenten hebben we de kristalstructuren van DgpA en het DgpB/C-complex bepaald met resoluties van respectievelijk 2,7 angstrom en 2,1 angstrom in figuur 3A tot D. We ontdekten verder dat de DgpA in auto-geremde bevestiging in zijn hexamere vorm in figuur 3B en C aanneemt, die werd gevalideerd met behulp van de DCPIP-reductietest in figuur 3F. Vervolgens ontdekten we dat glucose een waterstofbrugnetwerk vormt met belangrijke aminozuren in de substraatherkenningszak van DgpA in figuur 3E. Op basis hiervan hebben we mutanten ontworpen en hun substraatsplitsingsactiviteit geëvalueerd met behulp van kinetische parameters in figuur 3J.

Interessant is dat we tijdens de splitsing van O-glycosidische flavonoïden en DgpA/B/C de vorming van intermediaire verbindingen hebben waargenomen in figuur 4A en B. Deze tussenproducten werden geïdentificeerd als C-glycosidische flavonoïden door middel van NMR- en LC-MS-analyse in figuur 4C tot H, wat aangeeft dat DgpA/B/C O-glycosiden kan omzetten in C-glycosiden. We zijn een pionier in de integratie van chemie en biotechnologie om de structuur en functionele kenmerken van C-glycosidenmetabolisme-enzymen te bestuderen, wat aantoont dat dit een redelijke en praktische oplossing is. Deze aanpak vult hiaten in onderzoeksmethodologieën binnen het veld en kan gemakkelijk worden toegepast op andere genen met verschillende metabole functies.

Daarom biedt het ook een nieuw referentiemodel voor toekomstige studies naar de structurele en functionele kenmerken van andere microbiële functionele eiwitten in de darm.