Live beeldvorming van het recyclen van synaptische blaasjes in de neuromusculaire overgang van ontlede larvale zebravissen

We bestuderen het moleculaire en cellulaire mechanisme van synaptische transmissie met behulp van de neuromusculaire kruising van larvale zebravissen als modelsysteem. We zijn geïnteresseerd in het verduidelijken van de regulerende moderatie van de synaps in reactie op verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol stelt ons in staat om de door actiepotentiaal geïnduceerde nieuwe transmissie in de neuromusculaire kruising van larvale zebravissen te visualiseren met verbeterde gevoeligheid.

We kunnen de synaptische functie bewaken die wordt veroorzaakt door gematigde stimulatie, wat eerder niet is getest. Dit beeldvormingsprotocol kan worden uitgevoerd onder een conventionele epifluorescentiemicroscoop en vereist niet noodzakelijkerwijs een confocale laserscanningmicroscoop. Met andere woorden, deze methode biedt een kosteneffectief platform voor het beeldvormen van neuromusculaire functie in vergelijking met andere experimentele opstellingen.

Om 200 milliliter van de extracellulaire oplossing te bereiden, meng 6,4 milliliter van 3,5 molaire natriumchloride, 0,4 milliliter van een molaire kaliumchloride, 1 milliliter van een molaire HEPES, 0,4 milliliter van een molaire calciumchloride, 0,2 milliliter van een molaire magnesiumchloride en 360 milligram glucose. Voeg vervolgens ultrapuur water toe om het totale volume op 200 milliliter te brengen. Voeg 20 microliter van 15 millimolair D-tubocurarine-stapoplossing toe om 100 milliliter extracellulaire oplossing met 3 micromolair D-tubocurarine te bereiden.

Om 25 milliliter van de extracellulaire oplossing met 0,02% tricaïne te bereiden, voeg 0,5 milliliter van 1% tricaïne-stapoplossing toe aan 25 milliliter oplossing. Trek met behulp van een micropipettrekker de thetaglazen capillairen tot de tipdiameter binnen het bereik van 3 tot 10 micrometer. Vul de pipet met de extracellulaire oplossing.

Voer een dunne platinadraad in elk opening van het capillair in en houd de thetaglazen pipetelektrode op de pipethouders van de gemotoriseerde micromanipulator vast. Verbind vervolgens de achterkant van elke draad met de stimulusisolator. Voor 25 milliliter extracellulaire oplossing met 0,02% tricaïne in een glazen Petrischaal, breng een zebravislarve over naar de Petrischaal voor dissectie.

Gebruik twee fijne pincetten om de huid van de larve te pellen. Gebruik de eerste pincet om de larve op zijn plaats te houden en knijp met de andere pincet de huid aan de dorsale zijde van de zwemblaas. Verwijder vervolgens met een scalpel de zwemblaas, de inwendige organen en het hoofd.

Gebruik een glazen Pasteurpipet met een vuurgeslepen tip om het gedissecteerde zebravismonster over te brengen naar de beeldvormingskamer. Bevestig het monster mechanisch met een nylondraad die aan een C-vormige platinadraad is gelijmd om het ongeveer parallel aan de stimulerende elektrode te oriënteren. Perfuseer het monster met behulp van een zwaartekrachtstroomsysteem met een snelheid van 1 milliliter per minuut met een extracellulaire oplossing die 3 micromolair D-tubocurarine bevat.

Voer vervolgens de stimulatie-elektrode in in het ruggenmerg. Positioneer voorzichtig de elektrodetop nabij de spinale motorneuronen, geïdentificeerd als TagRFP-positieve neuronen die zich aan de ventrale kant van het ruggenmerg bevinden. Breng de elektrode onder een schuine hoek van het aangrenzende segment naar de doelpositie.

Selecteer op een computer het beeldvormingsgebied op basis van het live beeld van TagRFP-fluorescentie. Zorg ervoor dat het geselecteerde gebied meerdere boutons omvat en die nabij de grens van het lichaamssegment uitsluit. Schakel de fluorescentiefiltereenheid GFP-fluorine-fluorescentie voor beeldvorming in.

Pas vervolgens de intensiteit van de lichtbron aan om een helder beeld te verkrijgen in 1 hertz time-lapse-modus zonder verzadiging. Voer de belichtingstijd in 100 in het veld van de belichtingsduur in milliseconden van het micromanagervenster. Configureer de beeldverwervingssoftware en het digitale invoer/uitvoerapparaat om beeldverwerving te synchroniseren met elektrische stimulatie.

Bepaal vervolgens de stimulatiefrequentie, het aantal actiepotentialen en de tijdsvertraging tussen het begin van de beeldverwerving en de stimulatietoediening in het Arduino-script. Bereken op basis van deze instellingen het totale aantal beelden dat voor verwerving vereist is en voer deze waarde in het tellveld van het multidimensionale verwervingsvenster in micromanager. Stel een interval van 1 seconde in het intervalveld voor 1 hertz time-lapse beeldvorming.

Voor elektrische stimulatie configureert u de stimulusisolator om 1 milliseconde constante spanningspulsen van 70 millivolt te leveren. Voer de digitizeeropdracht uit om de beeldverwerving te starten. Controleer het proces om te verifiëren dat er geen onaanvaardbare beeldverschuiving is en dat fluorine en reacties waarneembaar zijn.

Pas de stimulatie-intensiteit aan, zoals frequentie in aantal pulsen, of pas de temperatuur aan op basis van het experimentele doel. Sla de time-lapse beelden op als een TIFF tijdreeksenstack. Synapsen met grote signaalverhogingen werden geselecteerd voor analyse, hoewel alle boutons detecteerbare veranderingen vertoonden in de 20 hertz 100 actiepotentiaal-conditie. Robuuste fluorine-reacties werden waargenomen bij hoogfrequente elektrische stimulatie met fluorescentie-veranderingen die exocytose tijdens stimulatie en daaropvolgende verval aangeven, wat endocytose en heracidificatie van synaptische blaasjes weerspiegelt.

Fluorescentie-vervaltijdconstanten varieerden met stimulus, intensiteit en temperatuur, waarbij 20 hertz 25 actiepotentialen bij 16,6 seconden, 20 hertz 100 actiepotentialen bij 56,8 seconden en 50 hertz 500 actiepotentialen bij 62,7 seconden werden gezien.