Preparaat van gewassen menselijke bloedplaatjes voor kwantitatieve metabole fluxstudies

Ik bestudeerde de impact van acute blootstelling aan oestrogeen op het centrale koolstofmetabolisme van bloedplaatjes en rust- en trombine-geactiveerde bloedplaatjes. We proberen te bepalen of acute blootstelling aan oestrogeen op bloedplaatjes bijdraagt aan de toename van het trombotische risico door het gebruik van orale anticonceptiva. Onderzoek naar de gezondheid van vrouwen is grotendeels ondergefinancierd.

Dit project maakte deel uit van een grotere oproep van de NIH om hiaten in de kennis over de gezondheid van vrouwen aan te pakken. Ondanks dat anticonceptiva al meer dan 50 jaar beschikbaar zijn, weten we nog steeds niet precies welk mechanisme resulteert in een hoger trombotisch risico. Biologische variabiliteit.

Traditionele celkweektechnieken zijn niet van toepassing op bloedplaatjes, wat betekent dat bloedplaatjes afkomstig zijn van donoren met verschillende genotypen. Er zijn grote steekproeven nodig, wat de noodzaak van een herhaalbare procedure voor de isolatie van bloedplaatjes benadrukt. Bestaande protocollen voor het wassen van bloedplaatjes zijn geschreven voor experts op het gebied van bloedplaatjesbiologie.

Er zijn een aantal unieke uitdagingen verbonden aan het werken aan bloedplaatjes die mijn protocol benadrukt voor de beginnende bloedplaatjesonderzoeker. Verwarm om te beginnen het waterbad voor op 37 graden Celsius en plaats er de gemodificeerde glucosebuffer van Tyrode in. Combineer het volbloed dat uit alle vacutainers is verzameld in een conische buis van polypropyleen van 50 milliliter.

Neem met behulp van een afgeschuinde pipetpunt een geschikt monstervolume om een celtelling uit te voeren. Zuig voorzichtig aan met een transferpipet met smalle boring om eventuele ontstane luchtbellen te verwijderen. Laat het bloed vervolgens 25 minuten rusten in een waterbad van 37 graden Celsius.

Om activering tijdens het centrifugeren te voorkomen, voegt u prostaglandine I2 en apyrase toe aan het volbloed en keert u de buis eenmaal om om het monster te mengen. Centrifugeer vervolgens het volbloed op 250G gedurende 15 minuten zonder pauze bij 37 graden Celsius. Verzamel de PRP, die verschijnt als de bovenste gele laag boven de buffy-vacht en rode bloedlaag in een nieuwe gekantelde conische buis van 50 milliliter langs de muur.

Laat de PRP 10 minuten rusten bij 37 graden Celsius. Meng de PRP na incubatie met 500 nanomolair prostaglandine I2 en 0,02 eenheden per milliliter apyrase. Centrifugeer het mengsel op 1.000 G gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius zonder versnelling en zonder pauze.

Gebruik nu een plastic transferpipet met brede boring, zuig het bovenstaande op voor het bulkvolume en gebruik vervolgens een pipet van één milliliter met een ongesneden punt om de resterende vloeistof in de buurt van de pellet op te zuigen. Voeg vervolgens prostaglandine I2 en apyrase-bevattende Tyrode-buffer toe aan de pellet, langs de zijkant van de conische buis. Gebruik een afgeschuinde punt en een pipetpunt van één milliliter om de pellet voorzichtig meerdere keren opnieuw te suspenderen.

Zodra de pellet opnieuw is gesuspendeerd, gebruikt u een transferpipet met brede boring om deze over te brengen naar een nieuwe conische buis, waarbij u eventuele rode bloedcellen of zichtbaar samengeklonterde cellen achterlaat. Neem vervolgens een monster voor flowcytometrie met behulp van een afgeschuinde pipetpunt. Incubeer de rest van de bloedplaatjes gedurende een uur bij 37 graden Celsius om de remmers te laten uitwerken.

Meng het monster na de incubatie voorzichtig met een pipet met brede boring en verdeel de monsters voor flowcytometrie. Het gemiddelde herstel van bloedplaatjes uit volbloed was ongeveer 52%, waarbij de besmetting van witte bloedcellen na het wasproces onder de 0,1% bleef. De blootstelling aan P-selectine was laag tijdens het wasproces, maar nam significant toe na behandeling met trombine.

Gebonden fibrinogeenspiegels piekten aanvankelijk na de eerste draai van 1.000 G, maar daalden tot onder de 5% na de tweede draai en namen weer aanzienlijk toe na de trombinebehandeling. Bloedplaatjes werden met succes afgeschermd voor grootte, singlets en CD42a-positiviteit voordat activeringsmarkers werden gemeten. Behandeling met trombine leidde tot een significante toename van de expressie van P-selectine en fibrinogeen in vergelijking met de controlegroep.

Verkrijg om te beginnen de gewassen bloedplaatjes uit menselijke bloedmonsters. Nadat de microcentrifuge is voorgekoeld tot nul graden Celsius, verzamelt u de bloedplaatjesuspensuspensie in gedeeltelijk bevroren normale zoutoplossing in een verhouding van 1:6. Centrifugeer het mengsel op 16.000 G gedurende 10 minuten bij nul graden Celsius.

Zuig het bovenstaande op in een afzonderlijke microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 0,5 milliliter voorgekoelde methanol:water van min 20 graden Celsius toe aan de gebluste pellet en draai krachtig gedurende een minuut. Vries het monster in vloeibare stikstof in en ontdooi bij nul graden Celsius.

Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 16.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en vang het bovenstaande op in een nieuwe microcentrifugebuis. Na het bovenstaande een nacht te hebben gedroogd, resuspendeer je het droge extract in 150 microliter water van LC/MS-kwaliteit en meng je het gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Draai kort en breng het extract over naar een microcentrifugebuis van 0,22 micrometer om celresten te verwijderen.

Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 16.000 G en vier graden Celsius. Piket na het centrifugeren nog eens 50 microliter water op het filter en centrifugeer opnieuw gedurende vijf minuten bij 16.000 G en vier graden Celsius. Verzamel ten slotte het filtraat voor analyse.

De lactaatproductie was positief in alle donormonsters, terwijl glucose en acetaat consequent werden geconsumeerd, waarbij trombine deze fluxen versterkte.