2.5D-model voor ex vivo mechanische karakterisering van kiemende angiogenese in levend weefsel

Het kwantificeren van de celmechanica die het ontkiemen van angiogenese in 3D-levende weefsels aanstuurt, is nog steeds moeilijk, en toch is het noodzakelijk om vooruitgang te blijven boeken op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Dit protocol maakt de taak toegankelijker door de toegankelijkheid van kwantitatieve 2D-methoden te combineren met de representativiteit van 3D-weefsels. Bestaande methoden voor de kwantificering van cellulaire krachten tijdens angiogene kieming in levend weefsel zijn beperkt tot complexe en rekenkundig dure 3D-krachtinferentie.

Ons protocol overbrugt in-vitrocontrole met in vivo relevantie door tractiekrachtmicroscopie aan te passen voor X-vivo-systemen en biedt een gebruiksvriendelijke maar fysiologisch relevante methode voor ruimtelijke temporele mechanische krachtkarakterisering. 2 Het Nav-D-model behoudt een fysiologische context en maakt kwantitatieve analyse van cellulaire mechanica mogelijk, en biedt een unieke benadering om de mechanica te bestuderen die kiemende angiogenese aanstuurt. Piket om te beginnen 120 microliter van de bindselaanoplossing in elk putje van een plaat met 12 putjes met glazen bodem.

Incubeer de plaat gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was na de incubatie de putjes drie keer met absolute ethanol met een spuitfles en droog de plaat af met stikstofgas. Pipetteer 11,5 microliter van het vers bereide polyacrylamide- of PAA-gelmengsel op de glazen bodem van elk putje.

Plaats voorzichtig een afdekglaasje van 13 millimeter op elke druppel. Voeg na polymerisatie PBS toe aan de put. Maak met een gebogen naald het dekglaasje voorzichtig los van de PAA-gel.

Gebruik vervolgens een pincet om het dekglaasje uit de put te verwijderen. Voeg 75 microliter van één milligram per milliliter sulfa sampa, opgelost in ultrapuur water, toe aan de PAA-gels. Plaats de plaat gedurende vijf minuten onder 365 nanometer ultraviolet licht.

Spoel de sulfa sampa op de gels snel af met PBS. Was vervolgens de gefunctionaliseerde PAA-gels twee keer met PBS gedurende elk 10 minuten. Pipetteer 50 microliter collageen 4-oplossing op de gefunctionaliseerde PAA-gels en incubeer een nacht bij vier graden Celsius.

Was de gels de volgende dag twee keer met PBS en laat ze vijf minuten drogen. Voeg 50 microliter endotheelcelgroei of ECG-medium toe aan de gels. Incubeer de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Om te beginnen brengt u met een steriel chirurgisch pincet de halsslagader van het varken over van de transportfles met gemodificeerde CREB-oplossing in een grote petrischaal gevuld met steriel PBS. Verwijder overtollig weefsel rond de halsslagader met behulp van een chirurgisch pincet en een scalpel. Snijd twee tot drie centimeter van beide uiteinden van de slagader af met behulp van een scalpel om gebieden in de buurt van slagadervertakkingen te elimineren.

Verwijder met behulp van een fijn pincet met ronde punt en een scalpel de arteriële fascia rond de halsslagader. Breng met een pincet de gereinigde halsslagader over naar een nieuwe grote petrischaal gevuld met PBS. Snijd de slagader in ringen van ongeveer twee millimeter breed.

Breng de ringen vervolgens over naar een voorverwarmd klein petrischaaltje met ECG-medium. Plaats de ringen op 37 graden Celsius. Om te beginnen brengt u met een pincet met ronde punt de ring van de halsslagader van het ECG over naar een middelgrote petrischaal gevuld met PBS.

Snijd met behulp van een pincet met ronde punt en een scalpel de ring doormidden en ontleed vervolgens een halve ring in vellen van ongeveer twee millimeter breed om arteriële vellen te maken met afmetingen van twee bij twee millimeter. Houd met een pincet met ronde punt het arteriële vel aan de achterkant vast en plaats het vel aan de rand van de PAA-gel met de endotheliale binnenbekleding naar het PAA-substraat gericht. Verplaats vervolgens met behulp van een pincet de arteriële plaat voorzichtig naar het midden van de PAA-hydrogel zonder de gel aan te raken.

Voeg 50 microliter ECG-medium toe aan de slagaderplaat en zorg ervoor dat de druppel op de gel blijft. Plaats met het pincet met ronde punt een droge afdekstrip van 13 millimeter op de arteriële plaat op het PAA-substraat in het medium. Gebruik de binnenrand van de glasbodem om de dekglaasjes voorzichtig te laten zakken totdat de middelgrote druppel zich eronder verspreidt.

Laat het weefsel vijf uur hechten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg daarna een milliliter ECG-medium toe aan elk putje. Incubeer de arteriële plaat op het PAA-substraat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.

Til de volgende dag met een gebogen naald voorzichtig het dekglaasje op en verwijder het met een pincet van het slagadervel. Verwijder het medium uit de put en het omliggende weefsel met behulp van een vacuümzuiging zonder het weefsel aan te raken, voeg een druppel van 10 microliter collageen type 1 gelmengsel toe aan elke arteriële plaat. Laat de gel een uur polymeriseren bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Voeg na de incubatie voorzichtig een milliliter voorverwarmd ECG-medium toe aan elk putje. Breng de plaat gedurende 24 uur over naar een broedmachine bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Een verhoogde hechtingsefficiëntie van arteriële platen werd waargenomen wanneer een onbehandelde dekstrook van 13 millimeter werd gebruikt, waardoor de enorme krachten tijdens het verwijderen werden geminimaliseerd.

Controleer na 24 uur kweek van de halsslagader van varkens in het 2.5D-systeem op ontkiemende angiogenese. Als er ontkiemende angiogenese wordt waargenomen, ververs dan het ECG-medium en plaats de plaat met 12 putjes in de fasehouder in de voorverwarmde incubatiebox van 37 graden Celsius van de microscoop. Selecteer het microscoopobjectief op basis van de beeldvormingsbehoeften.

Stel de belichtingstijd in en pas het scherpstelvlak aan met behulp van fasecontrastbeeldvorming. Voeg vervolgens het fluorescerende kanaal toe voor beeldvorming van de fluorescerende kralen en stel de belichtingstijd opnieuw in. Selecteer meerdere interessegebieden in het monster en pas het scherpstelvlak voor elke positie aan.

Definieer de time-lapse van interesse door een tijdsinterval van 5 tot 20 minuten en een duur van 4 tot 24 uur te selecteren. Schakel het scherpstelsysteem in om een stabiele scherpstelling te behouden tijdens de time-lapse-beeldvorming. Voeg vervolgens voor trekkrachtmicroscopie 5%SDS in ultrapuur water toe aan de put en wacht een paar minuten totdat de ontgroeiende cellen zijn losgekomen.

Verkrijg een Z-stapel fluorescerende markeringen in het PAA-substraat voor elke geselecteerde positie om een ontspannen toestand van de fluorescerende markeringen als referentiebeeld te verkrijgen. Gebruik aangepaste MATLAB-codes om time-lapse- en referentiebeelden te selecteren voor beeldverwerking en parameters voor analyse te definiëren. Lijn de time-lapse-beelden uit en snijd ze bij ten opzichte van de beste referentieafbeelding voor nauwkeurige analyse.

Meet de verplaatsing van fluorescerende markeringen in de PAA-hydrogel door asymmetrie van het deeltjesbeeld uit te voeren tussen het time-lapse-beeld en het referentiebeeld. Configureer de asymmetrieanalyse van het beeld om de afbeeldingen te verdelen in ondervragingsvensters van 32 bij 32 pixels met een overlap van 0,5. Bereken ten slotte de cellulaire trekkrachten op basis van de mechanische eigenschappen van de PAA-gel.

Vorming van cellulaire spruiten werd waargenomen in de 2,5D- en 3D-modellen van de arteriële plaat van het varken, die lijken op angiogene patronen, terwijl het 2D-model geen ontkiemende angiogenese vertoonde. De zachte substraatstijfheid van de PAA-hydrogel bevorderde vroege arteriële kiemangiogenese in vergelijking met een stijver PAA-substraat, wat matrixstijfheidseffecten aantoont. Tractiekrachtmicroscopie toonde aan dat cellulaire spruiten trekkrachten vertoonden bij uitsteeksels en duwkrachten langs de spruitas, aangedreven door leider- en volgcellen.