Cryosectie en immunokleuring van het binnenoorweefsel van muizen: van embryonale tot volwassen stadia

Mijn onderzoek richt zich op de neurologische ontwikkeling van het slakkenhuis. Specifiek wil ik de onderliggende mechanismen van SNAPS-vorming in het slakkenhuis blootleggen en het verband tussen de ziekte van Alzheimer en gehoorverlies onderzoeken. Live beeldvorming en genetische hulpmiddelen verbeteren ons vermogen om cochleaire structuren en neurale circuits gedetailleerder te bestuderen, waardoor we meer inzicht krijgen in de veerkracht en disfunctie van het auditorsysteem. Door dit protocol te publiceren, willen we onderzoekers helpen die nieuw zijn in de auditorwetenschap, vooral degenen die nog niet eerder met slakkenhuis hebben gewerkt. In deze gids wordt stap voor stap uitgelegd hoe u binnenoormonsters van embryonale, pasgeboren en volwassen muizen kunt bereiden. Ons doel is om experimenten met het binnenoor gemakkelijker te maken en ervoor te zorgen dat de resultaten betrouwbaar en consistent zijn. Immunokleuring met dwarsdoorsnede heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden, zoals immunokleuring op de hele berg. Het bewaart eiwitten en nucleïnezuren goed en creëert dunne, bijna 2D-secties, waardoor metingen nauwkeuriger en consistenter worden. Deze methode houdt ook alle cochleaire celtypen intact en zichtbaar, waardoor de cultus van immunokleuring wordt verbeterd. In tegenstelling tot preparaten voor de hele montuur, behoudt dwarsdoorsnede belangrijke structuren, zoals het spiraalvormige ligament, stria vascularis, het membraan van Reissner en het tectoriale membraan.

[Docent] Plaats om te beginnen de jonge geëuthanaseerde muis op een chirurgisch platform. Maak met een fijne dissectieschaar voorzichtig een incisie in de middellijn langs de hoofdhuid, beginnend bij de nek en zich uitstrekkend naar de snuit. Plaats vervolgens het onderste mes van de schaar bij het foramen magnum en het bovenste mes bij de schedel. Snijd de bovenste helft van de schedel tot aan de neus om de tweede snede te voltooien. Haal de schaar uit de gedeeltelijk ingesneden kop. Plaats het onderste mes van de schaar aan de onderkant van de schedel en het bovenste mes aan het foramen magnum. Snijd de onderste helft van het hoofd tot aan de neus om de derde snede te voltooien. Maak met een fijne tang en schaar voorzichtig al het zachte weefsel rond het slaapbeen los, inclusief de hersenen, spieren en bindweefsel. Plaats vervolgens de halve koppen van de muis in putjes van een plaat met 24 putjes met PBS. Vervang de PBS door 4% paraformaldehyde-oplossing voor fixatie en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel het weefsel na fixatie drie keer gedurende vijf tot 10 minuten met PBS. Zoek het slaapbeen of de binnenkant van het oorkapsel in de halve kop van de muis. Maak met een fijne tang voorzichtig het zachte weefsel rond het binnenoorkapsel los. Eenmaal losgemaakt, snijdt u het weefsel rond het binnenoorkapsel door. Oefen vervolgens lichte druk uit op het gebied rond de binnenoorcapsule met behulp van een tang om deze volledig los te maken. Bewaar de binnenoormonsters in PBS bij vier graden Celsius. Plaats om te beginnen de volwassen geëuthanaseerde muis op een chirurgisch platform. Maak met een scherpe dissectieschaar een incisie in de middellijn langs de hoofdhuid, beginnend bij de nek en zich uitstrekkend naar de snuit. Vouw de huid terug om de schedel bloot te leggen tijdens de eerste snede. Plaats het onderste mes van de schaar bij het foramen magnum en het bovenste mes bij de schedel. Snijd de bovenste helft van de schedel tot aan de neus om de tweede snede te voltooien. Haal de schaar uit de gedeeltelijk ingesneden kop. Plaats het onderste mes aan de basis van de schedel en het bovenste mes aan het foramen magnum. Snijd de onderste helft van het hoofd af tot aan de neus langs de middellijn, vermijd de binnenoren. Gebruik voor elke halve kop een tang en een schaar om zacht weefsel rond het slaapbeen los te maken, inclusief de hersenen, spieren en bindweefsel. Krul vervolgens het schedelweefsel omgekeerd met de vingers en gebruik de duim om zachte druk uit te oefenen op de onderkant van het slaapbeen. Maak het bot geleidelijk los van de omliggende aanhechtingen. Zodra de binnenoorcapsule is verwijderd, spoelt u deze grondig af met PBS. Plaats een Sylgard-schaaltje gevuld met 4% paraformaldehyde onder de microscoop. Plaats een enkele binnenoorcapsule in het schaaltje. Onderzoek het binnenoor op aangehecht zacht weefsel of bot en verwijder het voorzichtig. Identificeer het ovale venster en verwijder de stijgbeugels voorzichtig met een tang. Open vervolgens met een fijne tang een klein gaatje in de top van het slakkenhuis. Gebruik een P20-pipet gevuld met 4% paraformaldehyde om het slakkenhuis te spoelen om ervoor te zorgen dat vloeistoffen, zoals verdund bloed of endolymfe, door het ovale venster naar buiten komen. Breng het vaste slakkenhuis over in een plaat met 24 putjes gevuld met 4% paraformaldehyde. Markeer de tijd en incubeer gedurende 30 tot 60 minuten met zacht roeren met behulp van een tuimelschakelaar of moer. Spoel het monster na incubatie drie keer gedurende vijf tot 10 minuten met PBS. Plaats het slakkenhuis na de laatste spoeling in EDTA van 1,25 millimol en laat het twee tot drie dagen schommelen bij vier graden Celsius. Spoel na een EDTA-behandeling het slakkenhuis drie keer gedurende vijf minuten met PBS. Plaats om te beginnen de ontlede binnenoorcapsule in een 10% sucrose-oplossing en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Vervang na de incubatie de 10% sucrose-oplossing door 20% sucrose en incubeer nog twee uur. Vervang vervolgens de 20% sucrose-oplossing door 30% sucrose en incubeer het monster een nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag de helft van de 30% sucrose-oplossing. Vul de ruimte met een optimale snijtemperatuur of OCT-verbinding en laat het monster 30 minuten tot twee uur rocken. Breng de monsters over in gelabelde cryomolds gevuld met OCT-verbinding. Controleer de oriëntatie van het slakkenhuis in het ingebedde cryoblok. Zorg voor het binnenoor; De concave kant is gericht op de smalle zijden van de cryomold voor standaard cochleaire doorsneden. Plaats vervolgens droogijs in een kleine bak en voeg vijf tot 10 milliliter dimethylbutaan toe. Plaats de cryomallen met OCT en het monster op het borrelende droogijs om het blok snel te bevriezen. Breng de cryoblokken over naar de kamer van een cryostaat die vooraf is gekoeld tot min 20 graden Celsius. Laat de monsters 30 tot 60 minuten in evenwicht zijn. Markeer met een potlood of pen de zijkant van het cryoblok die overeenkomt met de cochleaire positie om de juiste oriëntatie voor het snijden te garanderen. Voeg vervolgens een kleine plas OCT toe aan de boorkop en plaats het cryoblok erop, waarbij u ervoor zorgt dat de brede kant zonder de potloodstreep naar beneden wijst. Plaats de klauwplaat met de OCT en het monster in de gekoelde cryostaatkamer, zodat de OCT volledig kan bevriezen. Plaats na een paar minuten de boorkop met het monster op de boorkophouder met de potloodmarkering naar rechts of links gericht. Snijd op een cryostaat het blok af met een instelling van 40 micrometer totdat het weefsel zichtbaar wordt. Zodra het weefsel zichtbaar is, oogst je een sectie van 12 micrometer met behulp van dia's die zijn ontworpen voor cryosectie. Controleer de locatie van de sectie onder een microscoop. Als u cochleaire bochten nadert, ga dan door met het oogsten van secties van 12 micrometer en controleer regelmatig de positie totdat alle cochleaire bochten zijn doorgesneden.