Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong
31 januari 2025
Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.
We bestuderen longherstel na virale infectie. We streven ernaar de mechanismen te begrijpen waarmee immuuncellen epitheelherstel mediëren en hoe hermodellering na virale beschadiging en daaropvolgend herstel toekomstige ziektepathologieën kan beïnvloeden. Dit protocol behandelt de onverenigbaarheid van longdigesten die zijn geoptimaliseerd voor epitheel- en stromale cellen of immuuncellen.
Ons onderzoek vereist het isoleren van levensvatbare cellen uit zowel immuun- als niet-immuuncompartimenten. Verder hebben we een poortstrategie voorgesteld voor subsets van epitheel en macrofaag, waarvan we hopen dat ze het veld ten goede zullen komen. Ons laboratorium onderzoekt de wisselwerking tussen immuun- en epitheelcellen in de luchtwegen onder steady-state omstandigheden en als reactie op omgevingsuitdagingen.
Ons uiteindelijke doel is om te bepalen hoe we deze communicatie het beste kunnen moduleren om weefselherstel te verbeteren en ziekteontwikkeling te voorkomen. Spuit om te beginnen de muis in met 70% ethanol. Maak met een fijne chirurgische schaar en een tang nummer zeven een incisie in de buik en snijd zijdelings door het buikvlies.
Maak een kleine snee in het diafragma om het vacuüm op te heffen. Snijd vervolgens het middenrif en de onderste ribbenkast uit de lichaamsholte om de longen en het hart bloot te leggen. Gebruik een spuit van 10 milliliter voorzien van een naald van 27 gauge en verfuseer de longen met vijf milliliter tweemolaire EDTA in DPBS.
Snijd verticaal door het borstbeen en langs de zijkanten om de ribbenkast te openen en de luchtpijp bloot te leggen. Gebruik een fijne schaar en een tang nummer zeven om zoveel mogelijk spieren en bindweefsel te verwijderen zonder de luchtpijp of longen te doorboren. Wikkel vervolgens de luchtpijp in met een 2/0 hechtdraad en positioneer deze alsof u hem wilt afbinden, maar draai hem niet vast.
Maak een laterale inkeping in de luchtpijp en breng de katheter in. Trek vervolgens de hechtdraad strak om de katheter op zijn plaats te houden. Blaas de longen op met een milliliter DPBS met behulp van een spuit.
Trek vervolgens langzaam de spuit terug om de DPBS eruit te trekken. Blaas de longen opnieuw op met dezelfde DPBS en trek de spuit opnieuw terug om de bronchoalveolaire spoelvloeistof of BAL op te vangen. Koppel de spuit los van de katheter terwijl u de katheter ingebracht laat.
Doseer de verzamelde klep in een microcentrifugebuis. Vul vervolgens dezelfde spuit van één milliliter met één milliliter dispase. Bevestig de spuit aan de katheter en blaas de longen op met dispase.
Span tijdens het verwijderen van de katheter de hechtdraad rond de luchtpijp aan om lekkage van dispase te voorkomen. Knip met een schaar zijdelings door de luchtpijp. Verwijder de longen uit de lichaamsholte door het bindweefsel langs de achterkant van de ribbenkast door te snijden terwijl u de longen en luchtpijp omhoog trekt.
Verwijder vervolgens het hart uit de longen. Plaats de longen in vijf milliliter DPBS op ijs. Centrifugeklep bij 400 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Zuig met een pipet het bovenstaande op en resusureer de pellet in 100 microliter RPMI. Ontleed om te beginnen de vijf lobben van de longen die van de muis zijn geoogst en gooi het bindweefsel weg. Hak het ontlede longweefsel met een schaar een minuut fijn op een glasplaatje.
Breng met een dissectieschaar het gehakte longweefsel over in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg vervolgens drie milliliter digestiemengsel toe en pipetteer het longdigestmengsel twee tot drie keer op en neer. Voeg ten slotte de celpellet toe die is teruggewonnen uit BAL die is geresuspendeerd in RPMI.
Plaats de buis in een hoek van 45 graden in een orbitale shaker die is ingesteld op 140 RPM bij 37 graden Celsius gedurende 40 minuten. Haal na de incubatie de buis uit de shaker en plaats deze op ijs. Pipetteer het longverteringsmengsel vijf tot zes keer op en neer.
Filtreer het mengsel door een celzeef van 70 micrometer in een nieuwe buis van 50 milliliter. Spoel de resterende cellen door het filter en neutraliseer de enzymen met 10 milliliter 5%FBS in het RPMI-medium. Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 600 G bij vier graden Celsius.
Zuig het bovenstaande op met behulp van een vacuümzuiger. Resuspendeer de celpellet in één milliliter ACK-lysisbuffer en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren. Voeg vervolgens negen milliliter PBS toe en pipetteer op en neer om de oplossing te mengen.
Nogmaals, centrifugeer het monster en gebruik een vacuümaspirator om het supernatant te verwijderen, en suspendeer vervolgens de celpellet in één milliliter fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer. Filtreer de suspensie door een gaas van 64 micrometer in een microcentrifugebuis voor flowcytometrie-analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de long van de muis in rusttoestand en na een influenzainfectie. Het biedt gating-strategieën voor het identificeren van epitheliale en myeloïde cel-subsets.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- De studie richt zich op longherstelmechanismen na een virale infectie.
- Inzicht in de rol van immuuncellen bij epitheliaal herstel is cruciaal.
- Het onderzoek richt zich op de uitdagingen bij het isoleren van levensvatbare cellen uit verschillende longcompartimenten.
- Er wordt onderzoek gedaan naar de interacties tussen immuun- en epitheelcellen in de luchtwegen.
Doel van de studie
- Om levensvatbare immuun- en niet-immuuncellen uit muizenlongen te isoleren.
- Om een gating-strategie te ontwikkelen voor het identificeren van specifieke celpopulaties.
- Om de impact van virale schade en herstel op toekomstige ziektepathologieën te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de long van muizen.
- Gating-strategieën voor het identificeren van epitheliale en myeloïde celsubsets.
- Analyse van longherstelmechanismen na influenzainfectie.
- Beoordeling van de crosstalk tussen immuuncellen en epitheelcellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van onderscheidende immuun- en niet-immuuncelpopulaties.
- Identificatie van specifieke epitheliale subsets en macrofaag-subsets.
- Inzichten in de mechanismen van longherstel na een virale infectie.
- Bijdrage aan het begrip van toekomstige ziektepathologieën gerelateerd aan longschade.
Conclusies
- Het protocol verbetert de mogelijkheid om immuunresponsen in de longen te bestuderen.
- Het biedt waardevolle instrumenten voor het onderzoek naar epitheliale herstelmechanismen.
- De bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar respiratoire aandoeningen informeren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De gelijktijdige isolatie van levende myeloïde en epitheliale celpopulaties uit de muizenlong maakt een uitgebreide analyse van de intercellulaire interactie in respiratoire ziektemodellen mogelijk. Deze capaciteit ondersteunt mechanistische risicobeperking en voorspellend vertrouwen tijdens de fasen van targetvalidatie en vroege ontdekking. De methode verbetert de besluitvorming over de portfolio door hoogwaardige, multiparametrische single-cell suspensies te leveren voor downstream-analyse.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe bestudering mogelijk van immuun-epitheliale interacties die cruciaal zijn voor target-validatie in longziektemodellen.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door functionele beoordeling van zowel immuun- als niet-immuuncompartimenten mogelijk te maken.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar herstel- en remodelleringspaden na letsel.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde single-cell suspensies die geschikt zijn voor flowcytometrie en FACS-gebaseerde screeningworkflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door de celisolatie te standaardiseren over immuun- en epitheelpopulaties.
- Maakt kwantitatieve gating-strategieën mogelijk voor een robuuste identificatie van cel-subsets in zowel naïeve als zieke toestanden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante muismodellen voor de ontdekking van translationele biomarkers in respiratoir onderzoek.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische validatie door analyse van cel-specifieke responsen op infectie of letsel mogelijk te maken.
- Vermindert biologische ambiguïteit in preklinische modellen door diverse celpopulaties in één enkele workflow vast te leggen.
Integratie van Pipeline en Workflow
Deze methode integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en ondersteunt workflows van targetvalidatie tot leadidentificatie in modellen voor respiratoire ziekten.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing mogelijk op de interactie tussen immuun- en epitheelcellen en de verduidelijking van signaalpaden bij longherstel.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gegevens over cel-subsets voor daaropvolgende screening van verbindingen of genetische varianten.
- Analytiek: Biedt multiparametrische flowcytometrie-outputs voor comparatieve analyse van ziektecondities en controlecondities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en preklinische eindpunten in modellen van infectie, allergie, fibrose en kanker.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar protocol dat aanpasbaar is binnen diverse respiratoire onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in longziekteonderzoek.
- Operationele waarde: Stroomlijnt celisolatie, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt high-throughput analyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door robuuste, multiparametrische datageneratie mogelijk te maken in een vroeg stadium van de pipeline.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van targets en modellen voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muizenlongdissectie, enzymatische digestie en flowcytometrie-analyse.
- Toegang tot FACS-instrumentatie en analytische infrastructuur voor multiparametrische gating is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van gating-strategieën en protocollen voor monsterverwerking.
- Aanpasbaar aan diverse muizenmodellen van respiratoire ziekten, maar kan optimalisatie vereisen voor specifieke eindpunten.
- Celviabiliteit en opbrengst zijn afhankelijk van de nauwkeurige uitvoering van de enzymatische en mechanische dissociatiestappen.
