Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Ons onderzoek onderzocht de afstamming van monocyten en macrofagen, met de nadruk op de opmerkelijke plasticiteit en het vermogen om meerdere signalen uit de omgeving te integreren om de effectorrespons vorm te geven tijdens ontsteking, weefselherstel en infecties. Macrofagen worden door het hele lichaam aangetroffen en coördineren de initiatie en oplossing van de aangeboren en aangepaste immuniteit die van invloed is op de beschermde en immuungemedieerde pathologie. Het herprogrammeren van macrofagen is de meest veelbelovende functie op dit gebied.

Opkomende omics-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in ons begrip van de biologie van macrofagen en biedt inzicht in hun fenotypische diversiteit, de functionele eigenschap, hun programmeerpotentieel en de ontwikkelingsoorsprong van deze cellen. Het belangrijkste obstakel en valkuil bij het ontdekken van macrofaagdifferentiatie en polarisatie zijn de heterogene experimentele omstandigheden en protocollen in de literatuur en het gebrek aan consensus bij het definiëren van de macrofaagterm. We demonstreren het herprogrammeringseffect van geneesmiddel- en lipidemediator op macrofaagpolarisatie en ontwikkelen een 3D in vitro model van interactie tussen macrofaag- en glioblastoomcellen.

Bovendien hebben we aangetoond dat bloedplaatjes de van monocyten afgeleide macrofaagdifferentiatie in licentie geven voor het N1-fenotype. Plaats om te beginnen anticoagulated perifere bloedmonsters in een centrifuge. Draai het 15 minuten op kamertemperatuur tot 200 G.

Let op de scheiding van bloedplaatjesrijk plasma aan de bovenkant en de cellulaire fractie, inclusief rode en witte bloedcellen, eronder. Verdun de cellulaire fractie verkregen uit de eerste centrifugatie met steriel PBS voorverwarmd tot kamertemperatuur. Homogeniseer de oplossing voorzichtig voordat u verder gaat met Ficoll-Hypaque-dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

Breng 15 milliliter Ficoll-Hypaque over in een steriele tube van 15 milliliter. Voeg voorzichtig en langzaam 30 milliliter verdund bloed toe aan de Ficoll, zodat de fasen zo min mogelijk worden gemengd. Centrifugeer de buis met het Ficoll en verdund bloed van 600 G gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder met een steriele pasteurpipet van drie milliliter een deel van de gele toplaag. Verzamel voorzichtig het raakvlak tussen de gele laag en de Ficoll-laag met een steriele pasteurpipet. Breng de verzamelde perifere mononucleaire bloedcellen, of PBMC's, over in een nieuwe buis van 15 milliliter die ten minste drie milliliter steriele PBS bevat.

Vul de tube bij met steriel PBS om een totaal volume van 12 tot 15 milliliter te bereiken. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 10 minuten op 600 G. Draai vervolgens de PBMC-suspensie vijf minuten lang op 300G bij 8 tot 10 graden Celsius.

Breng de cellen opnieuw in het gewenste volume steriele koude PBS met 2%FBS. Houd de cellen op 4 graden Celsius tot de volgende stap. Breng het gewenste volume PBMC-suspensie over in een buis van polystyreen met ronde bodem van vijf milliliter.

Voeg vervolgens 10 microliter positieve selectiecocktail toe voor elke 100 microliter celsuspensie. Meng de suspensie grondig voordat u deze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incubeert. Piket vervolgens 10 microliter magnetische nanodeeltjes per 100 microliter celsuspensie.

Pipeter meer dan vijf keer krachtig op en neer om een gelijkmatige suspensie van de magnetische nanodeeltjes te garanderen. Voeg na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur PBS met FBS en EDTA toe aan de suspensie om het totale volume op 2,5 milliliter te brengen. Pineer de cellen voorzichtig twee tot drie keer op en neer.

Plaats de buis in de magneetsorteerder en laat deze vijf minuten ongestoord staan. Keer de magneet samen met de buis in één continue beweging om. Houd de magneet en buis twee tot drie seconden omgekeerd voordat u ze weer rechtop zet.

Haal het buisje uit de magneet en voeg vervolgens weer 2,5 milliliter PBS-FBS-EDTA-buffer toe aan het buisje. Piket de celsuspensie voorzichtig twee tot drie keer op en neer om deze te mengen. Steek de buis terug in de magneet en zet deze vijf minuten apart.

Keer de magneet en de buis in één continue beweging opnieuw om en gooi de bovenstaande fractie weg. Verwijder de buis uit de magneet en suspendeer de cellen opnieuw in een geschikt volume PBS-FBS zonder EDTA. De positief geselecteerde cellen zijn nu klaar voor gebruik.

Voeg nu PBS-FBS-buffer toe aan de gesorteerde CD14-cellen, waardoor het totale volume op 12 tot 14 milliliter komt om de resterende EDTA te verdunnen. Centrifugeer op 600G gedurende 10 minuten. Na het weggooien van de supernatant, suspendeert u de positief geselecteerde CD14-monocyten opnieuw in twee milliliter PBS-FBS-buffer.

Tel de cellen met behulp van een automatische cellenteller. Bewaar de cellen op ijs tot de kweekvoorbereiding. Voor het kweken wordt de korrel opnieuw gesuspendeerd in een concentratie van één miljoen cellen per milliliter in aangevuld RPMI 1640-medium.

Pipetteer 250 microliter van de bereide celsuspensie in elk putje van een plaat met 48 putjes. Voeg 250 microliter met antibiotica aangevuld RPMI-medium met 50 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor toe aan elk putje. Incubeer de celkweekplaat in een bevochtigde incubator om macrofaagdifferentiatie te starten.

Vervang op dag vier van de macrofaagdifferentiatie de helft van het kweekmedium uit elk putje. Voeg cytokines of reagentia toe voor de gewenste polarisatieomstandigheden en ga nog drie dagen door met kweken. Oogst de van macrofagen afgeleide monocyten op dag zeven voor fenotypische karakterisering.

M1-macrofagen geïnduceerd door interferon gamma-plus lipopolysaccharide vertoonden de hoogste expressie van CD64, een afwezigheid van CD206 en lage niveaus van CD163 en MERTK. M2a-macrofagen geïnduceerd door interleukine 4 werden gekenmerkt door verhoogde CD206-expressie en verlaagde CD64-, CD163- en MERTK-spiegels. M2c-macrofagen geïnduceerd door interleukine 10 of dexamethason vertoonden verhoogde CD163- en CD14-expressie, intermediaire niveaus van CD64 en een toename van MERTK-expressie.