Name: Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer een gestandaardiseerd in-vitro model voor het reprogrammeren van humane monocyte-afgeleide macrofagen. Deze methode onderzoekt plasticiteit en polarisatie voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Nationale Agentschap voor de Bevordering van Wetenschap en Technologie (ANPCyT-FONCYT) door middel van subsidies PICT 2018-3070 en 2021-I-A-00807 aan E.A.C.S. en PICT 2021-I-A-00716 aan A.E.E, en door de Nationale Wetenschappelijke en Technische Onderzoeksraad (CONICET) door middel van de subsidie PIP 2022-0763 en door de Universiteit van Buenos Aires door middel van Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 aan A.E.E. E.A.C.S. en A.E.E. zijn carrièreonderzoekers bij CONICET.

Alle gezonde vrijwillige bloeddonoren hebben schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven en het onderzoek werd goedgekeurd door het Institutioneel Ethiekcomité van de Nationale Academie voor Geneeskunde (IMEX-CONICET-ANM) Argentinië. Zie de Tabel met materialen voor details over alle materialen en reagentia die in dit protocol zijn gebruikt.
1. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's)
OPMERKING: PBMC's worden geïsoleerd uit 40 mL anticoaguleerd perifeer bloed met natriumcitraat bij 3,8% en met behulp van Ficoll-Hypaque dichtheidsgradiënt (1077) centrifugatie. Dit protocol wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een BSL2 Bioveiligheidskast.
<ol>
	<li>Breng de ontvangen anticoaguleerde perifere bloedmonster over in geschikte 15 mL of 50 mL buisjes voor centrifugatie.</li>
	<li>Centrifugeer bloedmonsters bij 200 × g gedurende 15 min (versnelling: 4 vertraging: 2, wanneer het maximum 5 is) bij kamertemperatuur om het bloedplaatjesrijke plasma (PRP) bovenop en de cellulaire fractie, inclusief rode en witte bloedcellen eronder, te verkrijgen. Zie Figuur 1.</li>
	<li>Breng de bovenste fractie (PRP) over in 15 mL buisjes (als plasma wordt opgeslagen), en centrifugeer bij 600 × g gedurende 10 min (maximale versnelling en vertraging) om de laatste plasmafractie zonder bloedplaatjes te verkrijgen. Bewaar plasma bij -20 °C.</li>
	<li>Verdun de cellulaire fractie verkregen uit de eerste centrifugatie, minimaal 2x tot maximaal 3x met steriel 1x Fosfaat-gebufferd zout (1x PBS) voorverwarmd op kamertemperatuur. Homogeniseer het voorzichtig en gebruik deze verdunde fractie voor de Ficoll-Hypaque dichtheidsgradiënt centrifugatie.</li>
	<li>Breng 15 mL Ficoll-Hypaque over in een steriele 50 mL buis. Voeg dan voorzichtig en langzaam 30 mL verdund bloed toe bovenop de Ficoll, waarbij de fasen niet gemengd mogen worden. Als u met 10 mL of minder verdund bloed werkt, breng dan 4 mL Ficoll-Hypaque over in een 15 mL buis en voeg dan de 10 mL verdund bloedmonster toe. 
	OPMERKING: Deze stap is cruciaal om de mononucleaire fractie te verkrijgen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis met de Ficoll plus verdund bloed bij 600 × g gedurende 25 min (versnelling: 1; vertraging: 0) bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder een deel van de gele bovenste laag met een steriele 3 mL Pasteurpipet. Verzamel vervolgens voorzichtig de interface (mononucleaire "ring" fractie) gevormd tussen de gele bovenste laag en de Ficoll laag met een steriele Pasteurpipet. Deze "ring" bevat de mononucleaire cellen (PBMC) van belang. 
	OPMERKING: Een deel van de resterende plasma fase kan worden verzameld, maar zorg ervoor dat u de Ficoll fase vermijdt, aangezien deze giftig kan zijn voor de PBMC's.</li>
	<li>Breng de verzamelde PBMC's over in een nieuwe 15 mL buis met minimaal 3 mL steriele 1x PBS. Vul vervolgens op met het overeenkomstige volume steriele 1x PBS tot 12-15 mL. Centrifugeer de PBMC's bij 600 × g (maximale versnelling en vertraging) gedurende 10 min.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en was de PBMC's opnieuw. Resuspendeer het celpellet door 1 mL steriele 1x PBS toe te voegen, vul vervolgens op tot 12-14 mL met aanvullend steriele 1x PBS. Centrifugeer de buisjes bij 600 × g (maximale versnelling en vertraging) gedurende 10 min.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspendeer het PBMC pellet in steriele 1x PBS bevattend 2% geïnactiveerd foetaal runderserum (1x PBS-2% FBS) en breng het volume op tot 10 mL. Gebruik een automatische celteller of tel de cellen, bereid een 1:5 celsuspensie verdund in steriel koud 1x PBS en vervolgens (1:2) in Trypan Blauw om een ​​eindverdunning van 1:10 te verkrijgen. Gebruik een lichtmicroscoop voor het tellen.</li>
	<li>Spin de PBMC suspensie bij 300 × g gedurende 5 min bij 8-10 °C. Resuspendeer de cellen in een gewenst volume steriel, koud 1x PBS-2% FBS om een ​​eindconcentratie van 108 cellen/mL te verkrijgen. Laat deze cellen bij 4 °C tot de volgende stap. 
	OPMERKING: Als PBMC's die zijn verzameld niet op dezelfde dag worden gebruikt, is het aan te raden om ze in te vriezen in een cryogene buis bij 108 cellen/mL in geschikte invriesmedium (90% FBS bevattend 10% dimethylsulfoxide, DMSO). Bewaar bij -80 °C in een polyethyleenglycol container overnacht om de cellen langzaam te laten invriezen, waardoor celschade wordt geminimaliseerd. De volgende dag breng de cellen over naar een opslagbox en laat ze bij -80 °C gedurende een paar dagen of breng ze over naar een vloeibare stikstoftank voor een lange opslagperiode.</li>
</ol>
2. Sorteren van CD14+ monocyten met behulp van magnetische kralen
OPMERKING: De hoeveelheid CD14 monocyten gevonden in PBMC's van gezonde donoren varieert afhankelijk van leeftijd en geslacht. Gebruik indien beschikbaar een celteller om het % monocyten in elk monster te verkrijgen en bereken vervolgens het aantal PBMC's dat nodig is om de vereiste CD14 monocyten te sorteren. Als er geen celteller beschikbaar is, kan 10% monocyten per PBMC monster als een brede aanpak worden beschouwd4,6,<sup

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Guilliams, M., Svedberg, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+tissue+imprinting+restrict+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity.</a> Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).</li>
<li>Nowak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+monocyte+profile+in+patients+with+major+depressive+disorder+and+suicide+behaviour+and+how+ketamine+induces+anti-inflammatory+m2+macrophages+by+nmdar+and+mtor%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor.</a> EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).</li>
<li>Carestia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+promote+macrophage+polarization+toward+pro-inflammatory+phenotype+and+increase+survival+of+septic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice.</a> Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).</li>
<li>Olexen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+axl%28high%29+myeloid+cells+as+pathognomonic+marker+in+Langerhans+cell+histiocytosis+and+langerin+expression+dependence+of+mtor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition.</a> Clin Immunol. 263, 110203(2024).</li>
<li>Ortiz Wilczynski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthetic+phospholipid+C8-C1P+determines+pro-angiogenic+and+pro-reparative+features+in+human+macrophages+restraining+the+proinflammatory+M1-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype.</a> Front Immunol. 14, 1162671(2023).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+plasticity+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration.</a> Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+Nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Carrera Silva, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%28%2B%29CD1a%28%2B%29+cells+circulate+in+pediatric+patients+with+active+Langerhans+cell+histiocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis.</a> Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).</li>
<li>Ferrer, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+triggers+macrophage+activation+and+modulates+polarization+according+to+viral+strain+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity.</a> Front Immunol. 10, 2499(2019).</li>
<li>Gattas, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotypic+tridimensional+model+to+study+the+interaction+of+macrophages+and+glioblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro.</a> Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).</li>
<li>Ortiz Wilczynski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas6+signaling+tempers+Th17+development+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+helminth+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection.</a> PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).</li>
<li>Ambarus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+validation+of+specific+phenotypic+markers+for+in+vitro+polarized+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages.</a> J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+Time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13(2014).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+expressed+in+resting+and+IL-4+alternatively+activated+mouse+and+human+macrophages%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences.</a> Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+Maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Tiemessen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+induce+alternative+activation+of+human+monocytes%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).</li>
<li>Bosurgi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+function+in+tissue+repair+and+remodeling+requires+IL-4+or+IL-13+with+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells.</a> Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).</li>
<li>Sanin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+framework+of+monocyte-derived+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A common framework of monocyte-derived macrophage activation.</a> Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).</li>
<li>Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+functions+by+PPAR-alpha%2C+PPAR-gamma%2C+and+LXRS+in+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+M2c+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).</li>
<li>Mccoll, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+induce+protein+S-dependent+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils+by+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages.</a> J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+Nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Hawley, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNgamma+enhances+CD64-potentiated+phagocytosis+of+Treponema+pallidum+opsonized+with+human+syphilitic+serum+by+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages.</a> Front Immunol. 8, 1227(2017).</li>
<li>Akinrinmade, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD64%3A+An+attractive+immunotherapeutic+target+for+M1-type+macrophage+mediated+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases.</a> Biomedicines. 5 (3), 56(2017).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+Time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13(2014).</li>
<li>Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+identify+markers+of+distinctly+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages.</a> Front Immunol. 6, 253(2015).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+expressed+in+resting+and+IL-4+alternatively+activated+mouse+and+human+macrophages%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences.</a> Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).</li>
<li>Platanitis, E., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+networks+involving+STATs%2C+IRFs%2C+and+NFkappab+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation.</a> Front Immunol. 9, 2542(2018).</li>
<li>Laplante, M., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth+control+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth control and disease.</a> Cell. 149 (2), 274-293 (2012).</li>
<li>Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+macrophage+metabolism+and+activation+by+mTOR+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling.</a> Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).</li>
<li>Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eif4b+controls+survival+and+proliferation+and+is+regulated+by+proto-oncogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways.</a> Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Macrofagendifferentiatie, activering en polarisatie zijn een centraal thema geworden in de immunologie, weefselhomeostase, ziektepathogenese en ontstekingsresolutie. Bovendien benadrukt het opkomende beeld dat weefselmacrofagen afkomstig kunnen zijn van circulerende monocyten onder omstandigheden van verstoorde homeostase de noodzaak van nauwkeurige M-DM-modellen die worden gekenmerkt door gedefinieerde fenotypes, transcriptionele programma's en activeringsroutes.
Sommige cruciale stappen in d...

Macrofagen, voor het eerst geïdentificeerd door Metchnikoff voor hun fagocytische vermogen, zijn oude cellen die fundamenteel zijn voor het leven van Metazoa. Ze worden overal aangetroffen in volwassen zoogdieren en vertonen een opmerkelijke anatomische en functionele diversiteit. Als onderdeel van het mononucleaire fagocytische systeem, naast dendritische cellen en monocyten, spelen macrofagen een cruciale rol in verschillende biologische processen, van ontwikkeling en homeostase tot immuunresponsen tegen pathogenen1,2. Residente macrofagen, gespecialiseerd voor hun weefselmicro-omgevingen, fungeren als wachters die de weefselgezondheid controleren en reageren op fysiologische veranderingen en externe bedreigingen. Hun beperkte plasticiteit wordt gezien als een evolutionaire aanpassing om de weefselhomeostase te handhaven. In tegenstelling daarmee zijn gerekruteerd monocyten flexibeler en kunnen ze differentiëren in diverse macrofaagfenotypen tijdens ontstekingen. Deze dubbele invloed van ontsteking en weefselniche vormt de functionele diversiteit van macrofagen3. Dus, afhankelijk van het lokale weefselmilieu, kunnen monocyten-afgeleide macrofagen (M-DM) differentiëren in veel subtypen. De lokale metabolieten, groeifactoren, cytokinen en cel-cel interactie4,5,6 beschrijven hun fenotypes en functies. Bovendien zijn macrofagen belangrijke producenten van factoren die ontsteking dempen en re-vascularisatie en weefselreparatie stimuleren7,8.
Aangezien ten minste drie hoofdtakken de polarisatie beheersen (extrinsieke, intrinsieke en weefselmilieuomstandigheden), moet macrofaagpolarisatie worden beschouwd als multidimensionaal2. De belangrijkste obstakels en valkuilen bij het beschrijven van macrofaagdifferentiatie en polarisatie zijn de heterogene experimentele omstandigheden in de literatuur en het gebrek aan consensus over het definiëren van macrofaagtermen in in vitro en in vivo experimenten9. Niettemin is er enige unificatie van experimentele normen begonnen voor diverse experimentele scenario's.
Om het menselijk macrofagenveld beter te begrijpen, hebben we gestandaardiseerde en goed gedefinieerde in-vitro modellen van M-DM nodig om differentiatie, polarisatie, fenotype en herprogrammering, evenals specifieke functies te koppelen. Ons doel was om een gestandaardiseerd in-vitro model van humane niet-gepolariseerde M-DM M0 en cytokine-gepolariseerde macrofagen in te stellen om scheef reprogrammering van M-DM door flowcytometrie en real-time PCR te bestuderen. Hoewel macrofaagpolarisatie een dynamisch proces is vanwege hun hoge plasticiteit en vermogen om meerdere signalen uit hun omgeving te integreren, hebben we hier de niet-gepolariseerde M-DM (M0) en enkele in-vitro polarisatietoestanden gekarakteriseerd, zoals de klassieke pro-inflammatoire, ook bekend als M1, geïnduceerd met IFNγ en LPS. Evenzo kunnen de weefselreparatie en regulatorische M2 macrofagen worden gedefinieerd als M2a wanneer geïnduceerd met IL-4 en M2c wanneer gestimuleerd met dexamethason of IL-10. Deze polariserende toestanden vangen een momentopname van het brede M-DM-milieubereik in tijd en ruimte, maar geven ons enkele kardinale punten om de analytische kaart in te stellen waar de testomstandigheden kunnen worden gelokaliseerd.
Ondanks de complexe en dynamische combinatie van oppervlaktemarkers en transcriptionele programma's, hebben we bij het analyseren van in vitro M-DM vastgesteld dat CD64, CD206, CD163, CD14 en MERTK de ongepolariseerde M0-conditie kunnen scheiden van IFNγ/LPS-geïnduceerde M1, IL-4-geïnduceerde M2a en IL-10 of dexamethason-geïnduceerde door flowcytometrie. Bovendien werd de genexpressie van IRF1 en CXCL10 gedefinieerd als specifiek voor IFNγ/LPS-geïnduceerde M1; IRF4-, CCL22- en TGM2-specifieke transcripten voor IL-4-afgeleide M2a; en MERTK-gen voor dexamethason-afgeleide M2c, waardoor aanvullende kardinale punten worden ingesteld om de scheef reprogrammering van M-DM te vergelijken die worden uitgedaagd met verschillende stimuli of zelfs co-gecultiveerd met andere celtypen.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 mouse anti-human&nbsp; CD206 Antibody clone 15-2</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 321113; RRID:AB_571874</td><td></td></tr><tr><td>APC mouse anti-human CD64 Antibody clone 10.1</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 305013; RRID:AB_1595539</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 rat anti-mouse/human CD11b Antibody clone M1/70</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 101226; RRID:AB_830642</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>Cat# 554714</td><td>fixatie/permeabilisatie kit</td></tr><tr><td>Biotin anti-human MERTK Antibody clone 590H11G1E3</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 367616; RRID:AB_2721500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX-Connect apparatuur&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD14 Positive Selection Kit; EasySep Positive Selection Cocktail; EasySep magnetische Nanoparticles; Easy Sep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td><td>Cat# 18058</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto cytometer&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, Nieuw-Zeeland&nbsp;</td><td>Gibco&trade;&nbsp;Thermo Fisher Scientific Waltham, MA USA&nbsp;</td><td>Cat# 10091148</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Cytiva</td><td>GE Healthcare - Life Sciences, USA</td><td>Cat# 17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC.</td><td>RRID:SCR_008520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp;&nbsp;</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA-synthesekit, inclusief 5x reverse-transcriptiereactiemix, iScript reverse transcriptase, nuclease-vrij water</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>Partec CyFlow space cytometer&nbsp;</td><td>Sysmex Partec, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Streptavidin</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 405203</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 mouse anti-human CD14 Antibody clone HCD14</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 325618; RRID:AB_830691</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 mouse anti-human CD163 Antibody clone GHI/61</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 333607; RRID:AB_1134006</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco&trade;&nbsp;Thermo Fisher Scientific Waltham, MA USA&nbsp;</td><td>Cat# 11875119</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, bevat antilichaam-gemedieerde hot-start Sso7d fusiepolymerase, dNTP's, MgCl2, SYBR Green I-kleurstof, enhancers, stabilisatoren en een mix van passieve referentiekleurstoffen (inclusief ROX en fluoresceïne).</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1725271</td><td></td></tr><tr><td>TriZol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific Life Sciences Solutions Carlsbad, CA, USA&nbsp;</td><td>Cat#&nbsp; 15596026</td><td>RNA-extractiereagens</td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 423113</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

Cellen van de monocyte-macrofaag lijn zijn multifunctioneel en te vinden in bijna alle lichaamsweefsels. Ze coördineren de initiatiefase en afbouwfase van aangeboren en adaptieve immuniteit en hebben een significante invloed op beschermende immuniteit en immuun-gemedieerde pathologische schade. Terwijl weefsel-residente macrofagen sleutelrolspelers zijn in het handhaven van homeostase in een stabiele toestand, worden grote hoeveelheden monocyten uit het perifere bloed naar het weefsel gerekruteerd na schade of ontstekingsletsels. Monocyte-afgeleide macrofagen (M-DM) kunnen differentiëren in vele dynamische subtypes, en hun fenotipen en functies zijn afhankelijk van de lokale weefselomgeving.
Om verschillende stimuli of omgevingsomstandigheden tijdens M-DM differentiatie en polarisatie te vergelijken, hebben we een in-vitro model van menselijk niet-gepolariseerd M-DM M0 en enkele kardinale cytokine-gepolariseerde macrofagen, IFNγ/LPS-afgeleide M1, IL-4-afgeleide M2a en IL-10 of dexamethason-afgeleide M2c gestandaardiseerd, om de skewing herprogrammering van M-DM door flow cytometry en real-time PCR te analyseren. We vonden dat CD64, CD206, CD163, CD14 en MERTK ongepolariseerde M0 en gepolariseerde M1, M2a en M2c duidelijk kunnen onderscheiden door flow cytometry. Verder hebben we IRF1 en CXCL10 gedefinieerd als specifieke genen voor klassieke IFNγ/LPS-afgeleide M1-, IRF4-, CCL22-, en TGM2-specifieke transcripten voor IL-4-afgeleide M2a en het MERTK gen voor dexamethason-afgeleide M2c. Samenvattend zou ons gestandaardiseerde M-DM protocol de kardinale in-vitro kaart kunnen geven om de differentiatie en polarisatie van menselijk M-DM onder diverse stimuli te analyseren.

Op basis van ons jarenlange werk aan de karakterisering van macrofagen, hebben we een nauwkeurige combinatie van markers vastgesteld die de verschillende subsets van in-vitro M-DM duidelijk onderscheidt. De fenotype-markers zijn geselecteerd op basis van de literatuur en een uitgebreide eerdere screening die wij hebben uitgevoerd9,14,15,16,17. Daarnaa...

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Cells of the monocyte-macrophage lineage are multifunctional and found in almost all body tissues. They coordinate innate and adaptive immunity&#180;s ...

reprograming-model-human-monocyte-derived-macrophages-for-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

This video demonstrates the priming of primary monocytes into macrophages. Primary human monocytes can be isolated and differentiated to an M1-like pro-inflammatory phenotype using the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or to an M2-like anti-inflammatory phenotype using the macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft de robuuste generatie van macrofagen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en methoden voor hun latere karakterisering. Celoppervlaktemarkerexpressie, genexpressie en functionele tests worden gebruikt om het fenotype en de functie van deze iPSC-afgeleide macrofagen te beoordelen.

Productie en karakterisering van menselijke macrofagen uit pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van het immunomodulerende potentieel van implantaatoppervlakken in vitro, met als doel de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de huidige protocollen te verbeteren en verder onderzoek te bevorderen. Secretoire cytokineprofielen, mRNA-expressie en markers op het celoppervlak werden gecontroleerd met behulp van van bloedmonocyten afgeleide macrofagen om macrofaagpolarisatie te onderzoeken die op titanium werd gekweekt.

Polarisatie en karakterisering van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide macrofagen op implantaatoppervlakken 

Gezien de beperkte xenotransplantaatmodellen die beschikbaar zijn om interacties tussen menselijke CART- en myeloïde cellen te bestuderen, hebben we in vitro en in vivo modellen opgesteld om de effecten van menselijke macrofagen op CART-cellen te begrijpen. Bevindingen kunnen mogelijk worden gegeneraliseerd om de rol van macrofagen in de micro-omgeving van de tumor te evalueren en macrofaaggerichte immunotherapieën te testen.

Onderzoek naar interacties tussen myeloïde cellen en CAR T-cellen in vitro en in vivo

Leer een gestandaardiseerd in-vitro model voor het reprogrammeren van humane monocyte-afgeleide macrofagen. Deze methode onderzoekt plasticiteit en polarisatie voor immunologisch onderzoek.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Meer video's verkennen